分子生物学讲义

1、第1章 绪 论1. 1 分子生物学的含义分子生物学是研究核酸，蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征以及重要性、规律性和相互关系的科学；是人类从分子水平上真正揭开生物世界奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础科学。当人们认识到同一生物不同世代之间的连续性是由生物自身所携带的遗传物质所决定的，科学家为揭示这些遗传密码所进行的努力就成为人类征服自然界的一部分，而以生物大分子为研究对象的分子生物学就迅速地成为现代生物学领域里最具活力的科学。从广义上讲，蛋白质、核酸等生物大分子结构和功能研究都属于分子生物学的范畴。例如，蛋白质的结构、运动和功能，酶的作用机理和动力学，膜蛋白的结构、功

2、能和跨膜运输等都属于分子生物学的研究内容。不过目前人们通常采用狭义的概念，将分子生物学的范畴偏重于核酸（或基因）的分子生物学，主要研究基因的复制、表达和调节控制的过程。当然，其中也涉及到与这些过程有关的蛋白质和酶结构和功能的研究。1.2 分子生物学发展简史早在1871年Miescher就从脓细胞中分离出了脱氧核糖核酸（DNA），但当时并不认为它是生物体的遗传物质。直到1944年，Avery等人才通过肺炎链球菌的转化实验证实了DNA是生物体的遗传及变异的物质。在1949年查盖夫（Chargaff）测定出了DNA的碱基组成，并确定了DNA的碱基配对规律，与此同时威尔金斯（Wilkins）及弗兰金（

3、Frankin，19501952）用X射线衍射技术测定了DNA纤维结构，指出DNA是一种螺旋结构。在此基础上Watson和Crick于1953年提出了DNA的双螺旋结构模型，为充分揭示遗传信息的传递规律铺平了道路。为此他们和Wilkins于1962年共同获得了诺贝尔生理医学奖。DNA双螺旋结构模型理论奠定了分子生物学发展的基础。DNA双螺旋模型已经预示出了DNA的复制规则。科恩伯格（Kornberg）在1956年首先在大肠杆菌的无细胞提取液中实现了DNA的合成，并从大肠杆菌中分离出了DNA聚合酶，并证明DNA的合成需要一个模板DNA。奥乔尔（Uchoa）发现了细菌的多核苷酸磷酸化酶，成功的合成

4、了RNA，研究并重建了将基因内的遗传信息通过RNA中间体翻译成蛋白质的过程。他和Kornberg共享1959年的诺贝尔生理医学奖1965年，法国科学家Jacob和Monod由于提出并证实了“操纵子学说”而获得了诺贝尔生理医学奖。Jacob和Monod还首次提出存在一种与染色体DNA序列相互补，能将染色体DNA上的遗传信息带到蛋白质合成场所并翻译成蛋白质的核糖核酸，即mRNA分子。他们这一学说对分子生物学的发展起了极其重要的指导作用。Crick在1954年就提出了遗传信息的传递规律，称为“中心法则”，但RNA如何翻译成蛋白质的问题没有解决。直到1961年Yanofsky和Brener提出了三联密

5、码的设想，后来经过尼伦伯格（Nirenberg）和马夏（Matthai）的努力，终于于1963年破译了遗传密码。霍利（Holly）阐明了酵母丙氨酸tRNA的核苷酸序列，并证实所有的tRNA具有结构上的相似性。科拉纳（Khorana）（1966年）用有机化学方法合成了多聚脱氧核糖核酸，并以它为模板用DNA聚合酶合成DNA链，然后以DNA为模板合成了RNA。为此，Nirenberg 、Holly 、Khorana 分享了1968年的诺贝尔生理医学奖。按照中心法则，遗传信息是从DNARNA蛋白质。但是在RNA病毒中则是从DNAssRNA cDNA，这个过程必须有反转录酶发挥作用。泰明（Temin）和

6、鲍蒂毛（Baltimore）首先发现在RNA肿瘤病毒中存在反转录酶，因此他们获得了1975年的诺贝尔生理医学奖。现在，我们可以利用反转录酶，以分离得到的mRNA为模板合成cDNA，从而进行基因结构及其表达的研究。DNA是一个长链的生物分子，在研究DNA重组、表达质粒的构造，以及在DNA的碱基序列分析之前往往需要将DNA分子切割成较短的片段，这就需要一种酶来完成。史密斯（Smith）于1970年首先从大肠杆菌中分离出了第一个能切割DNA的酶。由于它能在DNA的专一位点上切割DNA分子，所以将这种酶称为限制性内切酶。目前已有数百种限制性内切酶作为商品出售，给分子生物学的研究带来了极大的方便。限制性

7、内切酶的分离成功，使重组DNA成为可能。1972年伯格（Berg）首次将不同的DNA片段连接起来，并且将这个重组的DNA分子有效的插入到细菌细胞之中，重组的DNA进行繁殖，于是产生了重组DNA的克隆。Berg是重组DNA和基因工程的创始人。桑格（Sanger）和吉尔伯特（Gilbert）两人则于1977年分别用酶法和化学方法测定了DNA的碱基序列，从而创建了DNA碱基序列分析的方法。Sanger和Gilbert发明的DNA序列分析方法至今仍在广泛使用，是分子生物学最重要的研究手段之一。为此，Berg、Sanger和Gilbert三人共获1980年的诺贝尔生理医学奖。1984年，德国遗传学家科勒

8、（Kohler）、美国人米尔斯坦（Milstein）和丹麦科学家杰尼（Jerne）由于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而分享了诺贝尔生理医学奖。 酶是蛋白质，这已经是多年来人们形成的一个固定的概念，但20世纪80年代有一个惊人的发现，即一些RNA也具有催化功能。在1982年切赫（T.Cech）发现四膜虫的核糖体RNA能够自我剪接。随后在1983年底S.Altman报导了在大肠杆菌RNA前体的加工过程中起作用的RNase是由20%的蛋白质和80%的RNA组成的，在除去蛋白质部分，并提高Mg2+浓度的情况下，余留下来的RNA部分仍具有与全酶相同的催化活性，这就说明RNA具有酶活性

9、。将这种具有催化功能的RNA称为核酶。因此他们获得了1989年的诺贝尔化学奖。毕晓普（Bishop）和瓦穆斯（Varmus）由于发现正常细胞同样带有原癌基因而分享了1989年的诺贝尔生理医学奖。1993年，美国科学家罗伯茨（Roberts）和夏普（Sharp）由于在断裂基因方面的工作而荣获诺贝尔生理医学奖。美国科学家马勒斯（Mullis）由于发明PCR仪而与第一个设计基因定点突变的Smith共享诺贝尔化学奖。1994年，美国科学家吉尔曼（Gilman）和罗德比尔（Rodbell）由于发现了G蛋白在细胞内信息传导中的作用而分享诺贝尔生理医学奖。我国生物科学家吴宪曾留学美国哈佛大学，回国后于192

10、41942年担任私立北京协和医学院生物化学教授，兼生物化学系主任教授，他与汪猷、张昌颖等人一道完成 了蛋白质变性理论、血液生化检测和免疫化学等一系列有重大影响的研究，成为我国生物化学界的先驱。在20世纪6080年代，我国科学家相继实现了人工全合成有生物学活性的结晶牛胰岛素，解出了三方二锌猪胰岛素的结晶结构，采用有机合成与酶促相结合的方法完成了酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工全合成。另外在酶学研究、蛋白质结构及生物膜结构与功能等方面都有世所瞩目的建树。1.3 分子生物学的研究内容如果从表面看，分子生物学涉猎范围极为广阔，研究的内容也似乎包罗万象，而事实上，它所研究的不外乎以下几个方面。1.3.1 D

11、NA重组技术（又称基因工程）DNA重组技术是20世纪70年代初兴起的的技术科学，目的是将不同的DNA片段（如某个基因或基因的一部分）按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。严格的说，DNA重组技术并不等于基因工程，因为它还包括其他使生物细胞基因组结构得到改造的体系。DNA重组技术是核酸化学、蛋白质化学、酶工程、遗传学、细胞学长期深入研究的结晶，而限制性内切酶、DNA连接酶及其他工具酶的发现与应用则是这一技术得以建立的关键。DNA重组技术有着广阔的应用前景。首先，它可被用于大量生产某些在正常细胞代谢中产量很低的多肽，如激素、抗生素、

12、酶类及抗体等，提高产量，降低成本，使很多有价值的多肽类物质得到广泛应用。例如美国科学家最近发现的用于治疗艾滋病的基因工程白细胞介素12（IL-12），可有效地阻止病情发展，恢复HIV病毒携带者的免疫系统和功能；由转基因烟草产生的-栝楼素也被用于抑制HIV的生长。其次，DNA重组技术可用于定向改造某些生物基因组结构，使它们所具备的特殊经济价值或功能得以成百上千倍地提高。例如有一种分解石油成分的重组DNA超级细菌，能快速分解石油，可用来恢复被石油污染的海域或土壤。美国科学家应用该技术构建了“工程沙门氏菌”，在研究避孕菌苗方面取得了重要进展。他们先取掉沙门氏菌致病基因部分，再引入来自精子的某些遗传信

13、息，将改造后的细菌送入雌鼠体内，发现能产生排斥精细胞的抗体，使精子不能与卵子结合，从而达到避孕目的。预计这种新型避孕菌苗将在今后几年内投放市场。此外，设在波士顿的美国陆军研究发展和工程中心还从织网蜘蛛中分离出合成蜘蛛丝的基因，并利用这一基因在实验室里生产蜘蛛丝。他们将这一基因转移到细菌内，生产出一种可溶性丝蛋白，经浓缩后纺成一种强度超过钢的特殊纤维。研究人员希望对该基因进行修饰，以生产出高性能纤维，从而用于制造防弹背心、帽子、降落伞绳索和其他高强度的轻型装备。第三，DNA重组技术还被用来进行基础研究。如果说，分子生物学研究的核心是遗传信息的传递和控制，那么根据中心法则，我们要研究的就是从DNA

14、到RNA，再到蛋白质的全过程，也即基因的表达与调控。在这里，无论是对启动子的研究（包括调控元件或称顺式作用元件），还是对转录因子的克隆与分析，都离不开重组DNA技术的应用。1.3.2 基因表达调控的研究因为蛋白质分子参与并控制了细胞的一切活动，而决定蛋白质结构和合成时序的信息都由核酸（主要是脱氧核糖核酸）分子编码，表现为特定的核苷酸序列，所以基因表达实质上就是遗传信息的转录和翻译。在个体生长发育过程中生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调节）。并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境调控）。基因表达的调控主要发生在转录水平和翻译水平上。原核生物的基因组和染色体结构都比真核生物简单，转录

15、和翻译在同一时间和空间内发生，基因表达的调控主要发生在转录水平。真核生物有细胞核结构，转录和翻译在时间和空间上都被分隔开，且在转录和翻译后都有复杂的的信息加工过程，其基因表达的调控可以发生在各种不同的水平上。基因表达调控研究主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑三个方面。信号传导是指外部信号通过细胞膜上的受体蛋白传到细胞内部，并激发诸如离子通透性、细胞形状或其他细胞功能方面的应答过程。当信号分子（配体）与相应的受体作用后，可以引发受体分子的构型变化，使之形成专一性的离子通道，也可以引发受体分子的蛋白激酶或磷酸酯酶活性，还可以通过受体分子指导合成cAMP、cGMP、肌醇三磷酸等第二信使

16、分子。研究认为，信号传导之所以能引起细胞功能的改变，主要是由于信号最后活化了某些蛋白质分子，使之发生构型变化，从而直接作用于靶位点，打开或关闭某些基因。转录因子是一群能与基因5´端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间和空间表达的蛋白质分子。在对植物的某些性状进行遗传分析时发现，某些基因的突变会影响其他基因的表达。例如，有20多个基因参与玉米花青素的合成，但其中的Cl、r、pl或b基因发生突变后，该代谢途径中的结构酶基因全部关闭。如果Antp、Flz或Ubx等基因发生突变，果蝇的体节发育就会受到影响，身体中的一部分就会变成相似于另一部分的结构，因此它们是控制果

17、蝇胚胎早期体节分化与身体发育的主要基因，它们所编码的蛋白质是调节与发育有关的结构基因的总开关。真核基因在结构上的不连续性是近十年来生物学上的重大发现之一，当基因转录成pre-mRNA后，除了在5端加帽和在3端加多聚Apoly(A)之外，还要将隔开各个编码区的内含子剪去，使外显子（编码区）相连后成为成熟mRNA。研究发现，有许多基因不是将它们的内含子全部剪去，而是在不同的细胞或不同的发育阶段有选择地剪接其中部分内含子，因此生成不同的mRNA和蛋白质分子。如降钙素基因、肌原蛋白基因和参与果蝇体细胞分化的dsx基因等，都采用有选择的剪接方式生成不同功能的蛋白质。由于RNA的选择性剪接不牵涉到遗传信息

18、的永久性改变，所以是真核基因表达调控中比较灵活的方式。 1.3.3 生物大分子结构与功能研究（又称结构分子生物学）一个生物大分子，无论是核酸、蛋白质或多糖，在发挥生物功能时，必须具备两个前提。首先，它拥有特定的空间结构（三维结构）；其次，它在发挥生物学功能的过程中必定存在着结构和构象的变化。结构分子生物学就是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能之间关系的科学。它包括结构的测定、结构运动变化规律的探索及结构与功能相互关系的建立三个主要方面。目前，最常见的研究三维结构及其运动规律的手段是X射线衍射晶体学（又称蛋白质晶体学），其次是用二维核磁共振和多维核磁共振研究液相结构，也有

19、人用电镜三维重组、电子衍射、中子衍射和各种频谱学方法研究生物高分子的空间结构。1.3.4 基因组、蛋白组计划与生物信息学研究2001年2月，世界两大最著名的学术刊物Nature和Science同时发表了人类基因组全序列，为确定基因对人类发育和疾病的诊断、防治以及新药的研究提供了一个前所未有的大舞台，生命科学界为之振奋。最新数据表明，科学家已绘制出40余种生物的基因组图谱，这极其大的丰富了人类的知识宝库，加快了人类认识自然和改造自然的步伐。虽然完成某一生物的基因组计划就意味着该物种所有遗传密码已经为人类所掌握，但测定基因组序列只是了解基因的第一步，因为基因组计划不可能直接阐明基因的功能，更不能预

20、测该基因所编码蛋白质的功能与活性，所以并不能指导人们充分准确地利用这些基因的产物。于是科学家又在基因组计划的基础上提出了“蛋白组计划”（又称“后基因组计划”或“功能基因组计划”，旨在快速、高效、大规模鉴定基因的产物和功能。蛋白质组计划是对细胞蛋白质的全面分析。它将一系列精细的技术，主要有2D-凝胶电泳、计算机图象分析、质谱、氨基酸测序和生物信息学结合起来，高通量地、综合地定量和鉴定蛋白质，建立人类和动物组织细胞生理、病理体系的蛋白质表达谱。建立蛋白组的生物信息数据库，将为重大病症的发生提供新的预警和诊断标志，并为新药的开发提供新的思路。巨大的基因组信息给科学家带来了前所未遇的挑战，相关数据的迅

21、速增长，使分子生物学与计算机科学的交叉学科生物信息学（bioinformatics）诞生了，其任务是储存和注释生物信息。日前已有核酸序列数据库、蛋白质序列数据库和结构数据库等的存在，并被广泛用于生物信息的识别、存储、分析、模拟和传输。没有生物信息学的知识，不借助于最先进的计算机科学，人类就不可能最大限度地开发和运用基因组学所产生的庞大数据。1.4 分子生物学展望从20世纪50年代初Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型至今，短短40多年间（还不足50年），生物学领域的变化岂只“沧海桑田”所能形容。核苷酸序列测定技术的进步，使人体基因组30亿个碱基全序列测定成为可能。20多年前，当人们

22、第一次谈到这个巨大的项目时，不免带有“谈虎变色”的感觉。X射线和其他高分子研究技术的相继问世，使建立生物大分子三维构象库梦想成真，到1994年已有2000余套蛋白质的构象入库；DNA重组技术的应用，使得基因克隆分析日益成为全世界数以万计的生物科学工作者手中的“常规武器”，近来每年都有上千个新的基因序列被存入基因文库。到1993年底为止，仅人类基因就有3808个已知序列，约占全部人体基因的3%。到1995年10月，全球范围内转基因植物的大田试验已有2000多次，有10多种植物被转化成功。20世纪中期以来，生物学正在各个学科之间广泛渗透，相互促进，不断深入和发展，既从宏观到微观、最基本和最复杂等不

23、同方向展开研究，也从分子水平、细胞水平、个体和群体等不同层次深入探索各种生物现象，逐步揭开生命奥秘。生物学革命也为数学、物理学、化学、信息、材料与工程学提出了许多新概念、新问题和新思路，促使这些学科在理论和方法上得到发展提高。生命世界的多样性和生命本质的一致性这个辨证的统一，已经为越来越多的人所接受。尽管生命过程在数以万计的不同生物中的表现形式可以是完全不同的，但生命活动的本质是高度统一的，如核苷酸序列与氨基酸序列，核酸与蛋白质一级结构的对应关系，在整个生命世界都是一致的。除极少数生物外，脱氧核糖核酸是地球上千百万生灵所共有的遗传信息载体。如果没有这个统一性，人们就不可能把某一基因从A生物转移

24、到B生物体内，得到表达并发挥相同的功能。从表面上看，动物和植物是两个完全不同的群体，它们以两种完全不同的方式摄取能量。动物靠的是氧化磷酸化，在食物的氧化过程中合成“生命的通用货币”腺苷三磷酸（ATP），而植物则通过光合作用，将光能转变为ATP，以供生命之需。动、植物代谢活动的实质是电子在一系列受体蛋白之间传递，造成膜内外质子梯度差，以合成ATP。生命活动这种高度一致性，使分子生物学研究日益渗透到生物学的各个领域，产生了全面的影响。分子生物学、细胞生物学和神经生物学被认为是当代生物学研究的三大主题，分子生物学的全面渗透推动了细胞生物学和神经生物学的发展。分子生物学研究技术的发展，几乎完全改变了科

25、学家对膜内外信号传导、离子通道的分子结构、功能特性及运转方式的认识。对突触部位神经递质的合成、维持、释放及其作用的分子机制研究在最近10年所取得的进展远远超过了以往几十年的总和。遗传学是分子生物学发展以来受影响最大的学科。孟德尔著名的皱皮豌豆和圆粒豌豆子代分离实验以及由此得到的遗传规律，纷纷在近20年内得到分子水平上的解释。越来越多的遗传学原理正在被分子水平的实验证实或摈弃，许多遗传病已得到控制和矫正，许多经典遗传学无法解决的问题和无法破译的奥秘，也相继被攻克，分子遗传学已成为人类了解、阐明和改造自然界的重要武器。分类和进化研究是生物学中最古老的领域，它们同样因分子生物学的渗透而获得了新生。过

26、去研究分类和进化，主要依靠生物体的形态，并辅以生理特征，来探讨生物间亲缘关系的远近。现在，反映不同生命活动中更为本质的核酸、蛋白质序列间的比较，已被大量用于分类和进化的研究。由于核酸技术的进步，科学家已经可能从已灭绝的化石里提取极为微量的DNA分子，并进行深入研究，以此确定这些生物在进化树上的地位分子生物学还对发育生物学研究产生了巨大的影响。人们早就知道，个体生长发育所需的全部信息都是储存在DNA序列中的，如果受精卵中的遗传信息不能按一定的时空顺序表达，个体发育规律就会被打乱，高度有序的生物世界就不复存在。大量分子水平的实验证明，同源转换区及同源转换结构域在个体发育过程中发挥了举足轻重的作用。

27、专家估计，这个领域的研究将为发育生物学带来一场革命。病毒致病的广泛性和严重性早在19世纪就已被描述。目前，天花虽然已被消灭，但艾滋病对人类的威协则有过之而无不及。世界范围内每15min就有1人被HIV病毒感染，估计到2000年全球将有4000万名HIV病毒感染者。此外，目前全球约有2亿人感染乙肝病毒（BIV），其中我国至少有1亿人带有该病毒。展望21世纪病理学、病原微生物学的发展，不难看出，分子病毒学研究将进一步阐明病毒致病的机制和规律，从而为克服病毒病这一人类的顽敌做出贡献。总之，分子生物学的发展揭示了生物体的高度有序性和一致性，是人类在认识论上的重大飞跃。生命活动的一致性，决定了下一个世纪

28、的生物学将是真正的统一生物学，是生物学范围内所有学科在分子水平上的统一。由于分子生物学、生物化学及生物物理学的影响，大量物理、化学工作者进入生物学领域，既有力地推动了生物学的发展，也极大地影响了这两个学科的发展。分子生物学不仅是目前自然科学中进展最迅速，最具活力和生气的领域，也将是21世纪的带头学科。总之，分子生物学的发展揭示了生物体的高度有序性和一致性，是人类在认识论上的重大飞跃。生命活动的一致性，决定了下一个世纪的生物学将是真正的统一生物学，是生物学范围内所有学科在分子水平上的统一。由于分子生物学、生物化学及生物物理学的影响，大量物理、化学工作者进入生物学领域，既有力地推动了生物学的发展，

29、也极大地影响了这两个学科的发展。分子生物学不仅是目前自然科学中进展最迅速，最具活力和生气的领域，也将是21世纪的带头学科。第2章 DNA的结构2.1 DNA的右手双螺旋结构在20世纪50年代初，有关DNA的结构已积累了不少资料。碱基分析表明，不同来源的DNA中总是A等于T，G等于C，即A/T=G/C=1，而G+C/A+T的比例却显示出很大的差别。DNA纤维的X-射线衍射图则指出，其中的原子沿长轴存在0.34nm和3.4nm两种周期，这提示分子可能具有螺旋构象。1953年Watson和Crick提出了DNA的双螺旋结构模型，合理的解释了上述现象。此模型描述的是B-DNA钠盐在一定湿度（相对湿度9

30、2%）下的结构。B-DNA的特征如下：由两条反平行的脱氧多核苷酸链围绕同一中心轴构成的右手双螺旋结构。在多核苷酸链中，脱氧核糖通过磷酸二酯键构成了主链。主链是亲水的，排在螺旋体的外侧，脱氧核糖环的平面与中心轴平行。这是DNA分子的骨架，是各种DNA分子都相同的部分。沿中心轴分布着四种碱基，碱基是疏水的，排在螺旋体的内侧。多核苷酸链的方向是由核苷酸间的磷酸二酯键的走向决定的，一条从53，另一长从35。链间有螺旋的凹槽，其中一条窄而浅，叫小沟；一条宽而深，叫大沟。两条链上的碱基以氢键相联，A与T配对，G与C配对，碱基杂环上的氧呈酮基，氮呈氨基，从而使相互之间形成氢键，A与T以两个氢键相联，G与C以

31、三个氢键相联。碱基的平面与中心轴垂直，而且螺旋的轴心穿过氢键的中心。相邻碱基平面之间的距离为0.34nm，每一圈螺旋含10个碱基，它在中心轴上的距离为3.4nm。双螺旋的直径为2.0nm。0.34nm相当于碱基环的厚度，这表明碱基对是紧密堆积的，相互之间存在着堆积力。正是DNA双螺旋链中碱基间的疏水作用、碱基间的氢键和堆积力使DNA形成稳定的双螺旋结构。图2.1 B-DNA结构示意图B-DNA的双螺旋结构很稳定，但不是绝对的，它在环境中不停地运动，如室温下DNA溶液中有部分氢键断开，造成这些部位结构多变。水溶液及细胞中天然状态DNA大多为B-DNA，但若湿度改变（如相对湿度低于75%时）或由D

32、NA钠盐变为钾盐、铯盐等则会引起构象变化，形成A-DNA、C-DNA等构象。在核酸的右手螺旋中，螺旋盘绕的松紧程度受DNA分子内力的影响，若B-DNA盘绕过紧，则会变构为A-DNA。在纯化DNA时，采用乙醇沉淀法，在整个过程中大部分DNA由B-DNA经过C-DNA，最终变成A-DNA。由于它是B-DNA拧得更紧的状态，所以它在二级结构上发生了比较明显的变化B-DNA的碱基对平面与双螺旋的轴线呈垂直状态，而A-DNA的碱基对平面与轴线之间呈20°倾角。A-DNA的轴心不再穿过碱基对之间的的氢键中心，而是位于碱基对之外。这一偏轴心结构主要是由于DNA 片段中核苷酸亲水疏水性改变所致。B-

33、DNA每一螺旋含有10个碱基对，而在A-DNA中则含有11个碱基对。B-DNA双螺旋中，在大沟、小沟的深度是相差不太大，只是大沟较宽。变成A-DNA后，大沟变窄、变深，小沟变宽、变浅。由于大沟、小沟是DNA行使功能时蛋白质的识别位点，所以由B-DNA变为A-DNA后，蛋白质对DNA分子的识别也发生了相应变化。DNA脱水时由B-DNA变成A-DNA，DNA分子中的一条被相应的RNA所取代时，形成的DNA-RNA双螺旋也是A型结构。所以，当DNA处在转录状态时，DNA模板与由它转录所得的RNA形成的双链就是A型构象。由此可见A-DNA构象对基因表达具有重要意义。此外，由两条RNA链形成的双螺旋结构

34、也是A型构象。除A-DNA和B-DNA螺旋结构外，还存在着B-DNA、C-DNA、D-DNA等双螺旋结构。各种右手双螺旋DNA的结构参数见表2.1。表2.1 不同右手双螺旋DNA的结构参数双螺旋类型碱基倾角(°)碱基夹角(°)碱基间距离（nm）螺距（nm）每圈碱基数小沟宽/小沟深（nm）大沟宽/大沟深（nm）B-DNA036.00.3373.4100.57/0.751.17/0.85C-DNA638.00.3313.19.30.48/0.791.05/0.75A-DNA2032.70.2562.8111.10/0.280.27/1.35D-DNA45.00.3030.13/

35、0.670.89/0.582.2 左手双螺旋DNAZ-DNA是1979年由Rich提出的。Rich在对d（CGCGCG）结晶进行X-射线衍射分析后提出了Z-DNA结构模型。左手螺旋的Z-DNA是对右手螺旋结构模型的一个补充和发展，现已证明细胞内的B-DNA中有时会存在一小段Z-DNA螺旋结构。图2.2 Z-DNA与B-DNAZ-DNA有如下结构特点：Z-DNA是左手螺旋，每个螺旋含12个碱基对，比A-DNA拧得更紧。双螺旋中不存在深沟，只有浅沟。双螺旋的轴心也在碱基对之外，即轴心不穿过碱基对之间的氢键。Z-DNA中磷酸二酯键的连接不再呈B-DNA中的光滑状，而是呈锯齿状，这就是Z-DNA名称的

36、由来。Z-DNA中的碱基对不像B-DNA中那样位于双链的中央，G碱基的第8个碳位于双链之外（在B-DNA中，糖、磷酸键覆盖了C8位置）。由于Z-DNA上几乎不存在易被蛋白质识别的沟，Z-DNA可能借助于双链分子外围的G碱基与化学物质发生识别反应。 B-DNA是活性很高的DNA构象，B-DNA变构为A-DNA后，仍有活性，但若局部变构为Z-DNA后活性明显降低。Z-DNA在天然DNA中的存在表明它应有自己独特的功能，Z-DNA的存在可能与基因表达的调控有关。现已提出两个Z-DNA调控转录的模式。邻近调控系统中，与调控区相邻的转录区被Z-DNA抑制，只有当Z-DNA转变为B-DNA后，转录得以活化

37、。图2.3 邻近调控系统示意图远距离调控系统中，Z-DNA可通过改变负超螺旋水平，决定RNA聚合酶能否与模板链相结合而调节转录起始活性。图2.4 远距离调控系统示意图2.3 双链环形DNA生物体内的有些DNA是以双链环形DNA的形式存在的。有些环形DNA还可以进一步形成超螺旋，或称连锁状DNA。2.4 三链DNA图2.5 双链环形DNA早在1957年，Davis，Felsenfied及Rich等3人就提出了三链核酸结构的概念，他们以两条poly（U）和一条poly（A）链合成出一种三链物质。但当时并未引起人们的注意。主要原因是因为当时Watson和Crick的双螺旋模型刚提出不久，它解释了很多

38、遗传现象，而三螺旋模型却对此无能为力。此外还由于这种三链结构是由RNA形成的而非DNA。于是除了少数物理化学家外，人们对这种实验室合成出的三链物质没有太多兴趣。图2.6 三链DNA结构示意图1987年，Mirkin等从准天然途径中发现了DNA的三螺旋结构，这为三螺旋DNA在生物体内存在的可能性带来了希望之光。以此为转机，对三链DNA研究的势头在国内外兴盛起来。Mirkin等在酸性溶液的质粒中发现了DNA的一种三链结构，称为H-DNA（“绞链”DNA）。1990年底，白春礼等在用扫描隧道显微镜（STM）研究噬菌体DNA-Hind 的变异结构时，发现了一种新的三链DNA结构，称为三辫状DNA。白春

39、礼等人不仅从获得的图象上看到了由三条DNA链形成的发辫状三链结构，并且还观察到由双螺旋结构片段与三链辫状结构片段的衔接结构。这种前所未有的三链DNA结构引起了国内外学术界的关注。目前所发现的三链DNA都是由多聚嘌呤和多聚嘧啶片段构成的。在三链结构中，多聚嘌呤和多聚嘧啶（即原有的两条链）是反平行的双螺旋，第三条链则结合有双螺旋的大沟中。三链DNA的生物学作用目前仍知之甚少，对其生物学意义只能进行一些预测，但人们在研究工作中已经将热点集中在以下两个方面。三链DNA有特异裂解正常DNA分子的功能，当第三条链与双链DNA特异地结合成三链DNA后，可使双链DNA在特异位点上裂解。所以，三链DNA充当了“

40、分子剪刀”。三链DNA在基因转录过程中起诱导、阻断作用。第三条链的存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区结合，因而阻断有关基因的转录。可以预想，人们一旦在细胞水平上掌握了这种功能后，就能够通过三链阻断转录机制来治疗一些遗传性疾病和病毒性疾病，如爱兹病、乙肝等。所以三链DNA的生物学作用是值得人们深入研究的问题。 2.5 超螺旋DNA超螺旋DNA最早是在SV40（猿猴病毒40）和多瘤病毒中发现的。当SV40的DNA从被感染细胞中分离出来时，它与组蛋白结合形成核小体，如果使DNA与组蛋白分离，DNA就成为超螺旋。后来逐渐发现，形成超螺旋是病毒、细菌以及真核细胞DNA的普遍特性。超螺旋DN

41、A是DNA高级结构的主要形式，可分为负超螺旋和正超螺旋两大类，它们在特殊情况下可以互变。B-DNA结构中，一般每转一圈有10个核苷酸对。平时，双螺旋总处在能量最低状态。若将DNA双螺旋额外地多转几圈或少转几圈，使每圈的核苷酸数目大于或小于10，就会出现双螺旋空间结构的改变，在DNA分子中产生额外的张力。若此时双螺旋的末端是自由的，可通过链的转动来释放这种额外的张力，从而保持原来的双螺旋结构；若此时DNA分子的末端是固定的或是环状分子，双链不能自由转动，额外的张力就不能释放而导致DNA分子内部原子空间位置的重排，造成扭曲，即出现超螺旋结构。由此可见，B-DNA双螺旋分子的链间螺旋数若发生变化，就

42、会出现超螺旋结构，而且超螺旋的绕数与B-DNA的链间螺旋数有密切关系。研究细菌中制备的质粒DNA（环状双链DNA）发现，天然状态下以负超螺旋为主，稍被破坏即出现开环结构，两条链均断开则呈线性结构。电泳时，在直流电场的作用下，相同相对分子质量的超螺旋DNA比线性DNA迁移率大，线性比开环的迁移率大，以此可将不同形状的DNA分开，亦可判断质粒结构是否被破坏。琼脂糖凝胶电泳现已成为检测DNA螺旋程度的一种最直接的方法，它能够分离仅差一圈的超螺旋DNA。另外，由于超螺旋DNA具有更加致密的结构，在离心场中的沉降速度增加，所以超速离心也是分离超螺旋DNA的一种的效方法。DNA分子的这一变化可以用一数学公

43、式来表示：L = T + W图2.7 环形DNA与超螺旋DNA的结构变化示意图其中L为连接数，是指开环DNA分子两条链间的交叉次数。只要不发生链的断裂，L是个常数。T为双螺旋的盘绕数，W为超螺旋数，它们是变量。例如：某一B-DNA共有250碱基对，每一圈螺旋含10个碱基，所以，L和T都是25，这时W=0，不存在超螺旋。现在若将DNA分子的一端固定，另一端朝双螺旋相反的方向旋转2圈后使两端封闭（此时L=23），分子的张力可以按两种方式分布，一种在分子内保留一个单链区，即T也减为23。W仍然为0。由于DNA趋向于保持B-DNA，因此张力分布的另一种方式为：使T维持原来的25，L既是定值，仍为23，

44、为了满足上述方程，W必须等于-2，该DNA就成为超盘绕2次的负超螺旋。超螺旋是DNA三级结构的一种普遍形式，双螺旋DNA的松开导致负超螺旋，而拧紧则导致形成正超螺旋。由于DNA趋向于保持B-DNA，因此张力分布的另一种方式为：使T维持原来的25，L既是定值，仍为23，为了满足上述方程，W必须等于-2，该DNA就成为超盘绕2次的负超螺旋。超螺旋是DNA三级结构的一种普遍形式，双螺旋DNA的松开导致负超螺旋，而拧紧则导致形成正超螺旋。虽然超螺旋最早在环形DNA中发现，但许多证据表明线性DNA也可以超螺旋化。研究真核细胞染色体DNA在天然状态下的结构特点证明，染色体大多沿着两种主要DNA结合蛋白骨架

45、形成大量连续的环状区域。每一个环中的DNA独立形成超螺旋并具有不同的张力，骨架的存在防止了将一个环中的DNA扭力传递到另一个环中去，而这些环大多是染色体的功能单位。Z-DNA的形成也对DNA的超螺旋化有重要意义。如B-DNA中有一个右手螺旋转换成Z-DNA的左手螺旋圈，则T值就改变2，W也相应改变2，说明只要有一小段DNA由B-DNA转变为Z-DNA，DNA的超螺旋结构就可能发生很大变化，这种变化对基因表达的调控是不可缺少的。螺旋是DNA的一种受力状态，负超螺旋DNA分子所经受的张力会引起互补链的分开，导致局部变性（富含AT碱基对的区段），局部变性无凝是DNA复制和转录所必需的。负超螺旋DNA

46、在功能上的这一重要意义已得到了实验的证实。DNA可以在各个拓扑异构体之间转换，这种转换是一类被称为拓扑异构酶的蛋白质催化的。拓扑异构酶是一类催化DNA由一种拓扑异构体转变为另一种拓扑异构体的酶。这种转变是通过改变L值来实现的。原核生物的拓扑异构酶（又称为旋转酶）可利用ATP中的能量使DNA按左手方向松开，从而产生负超螺旋（真核细胞的同种酶除了ATP之外，还需要目前尚不清楚的蛋白质存在才能产生负超螺旋）；拓扑异构酶则使细胞中的超螺旋DNA转变为无张力的、能量上占优势的松弛态DNA。两种拓扑异酶的作用相互抗衡，在细胞中，两种酶的量是经过精细调节的，从而使DNA的负超螺旋程度恰到好处。型和型的拓扑异

47、构酶都是通过催化DNA主链的磷酸二酯键断裂和重新连接来发挥作用的。即它们的功能是在DNA分子的一条链多核苷酸链 (或两条多核苷酸链)上产生一个暂时的断口，形成的两个末端分别与拓扑异酶的两个亚基相连，然后使另一条末断裂的多核苷酸链(或两条多核苷酸链)穿过酶（亚基之间）和断口之后，两末端又重新相连，断口又闭合。所不同的是拓扑异构酶作用的结果使L值增加1，所以负超螺旋数减少1。拓扑异构酶作用的结果使L值减少1，所以负超螺旋数增加1。但实际上它们的作用过程是相当复杂的。图2.7 核小体结构示意图真核生物细胞核中DNA的三级结构是另一种类型的超螺旋结构。在1974年，人们通过电子显微镜观察到染色质呈串珠

48、状结构，基本重复单位就是核小体。核小体内有组蛋白八聚体（H2A、H2B）2、（H3、H4）2，外面缠绕着1.75圈长度约140bp的DNA，其外形呈矮圆柱状。相邻核小体之间由长约60bp 的DNA连接，称为连接线（linker）。H1位于连接区，可能和核小体组装成更高一级的结构有关。所以，核小体是由五种组蛋白及200bp的DNA构成。人类细胞核平均直径为5m。细胞中3×109bp的DNA存在于22对常染色体和X、Y染色体中，如按每条染色体含1.5×108bp的DNA线性分子，每个核小体DNA平均为200bp计算，应有7.5×105个核小体存在，其伸展长度为7mm，

49、远非细胞核所能容纳。X-射线衍射技术确定核小体直径约为11nm，要在有关核蛋白的协同下组成以6个核小体为一周，直径30nm的紧密结构，即光学显微镜下可见的染色质纤维，此时人类基因组已压缩到1mm的长度。图2.9 真核生物染色体的组装在两栖类未成熟的卵母细胞间期核中，可在光学显微镜下见到一种灯刷状染色体（lampbrush chromosome）结构，是在转录高度活跃的DNA与蛋白质形成核蛋白复合体的基础上构成的，灯刷染色体进一步形成大环状结构（looped domain），通过结合在大环基部的蛋白质相互连接或基部直接连接在染色质扣轴上，每个环的长度约为20100kb，高度约为300nm。含有这

50、种环状结构的染色质DNA再进而盘绕成700nm的染色单体。经过这一系列的组装，人类DNA可通过2 000个大环最终浓缩30万倍而组装在染色体中。第3章 基因的现代概念随着分子生物学和分子遗传学的不断进步，使得人们要给基因下一个确切的定义已越来越困难，因为基因的旧概念被不断突破：过去认为基因是为蛋白质编码的DNA片段以及一个基因一个酶，现在发现的许多非编码基因修正了这个概念。过去认为基因是可以表达的，现在却发现了许多非表达基因；如果把基因看成一段连续的DNA序列，这个概念被现在发现的断裂基因打破。把基因看成一段固定的DNA序列，而又发现了许多可移动的基因。如果说基因是DNA链上的一段独立序列，那

51、么它也要被现在发现的重叠基因修正。很长一段时间，人们认为基因始终在DNA上，遗传信息流总是从DNARNA，这个概念也要修正了，因为逆转录酶的发现证明了遗传信息可以从RNA反向流至DNA，特别是最近发现的反转子和反转录转座子等使基因的概念得到更大的发展。3.1 移动基因移动基因又叫转位因子。由于它可以从染色体基因组上的一个位置移动到另一个位置，甚至在不同的染色体之间跃迁，因此又称为跳跃基因。移动基因是20世纪40年代美国冷泉港实验室的一位年轻的女科学家（B.McClintock）首先在玉米上发现的。由于它们的移动可引起染色体的重排，影响基因的表达，所以当时称为“控制因子”。根据移动基因的结构不同

52、将它们分为两类：插入序列（insertion sequence，简称IS）和转座子（transposor，简称Tn）。3.1.1 插入序列（IS因子）插入序列，现在一般叫做IS因子，它是在细菌中首先发现的最简单的一类转位因子。其长度为数百个核苷酸对至一两千个核苷酸对，相当于12个基因的编码量。表3.1 若干种大肠杆菌IS因子的基本参数IS因子名称分子大小（bp）反向重复序列（bp）靶位点的同向重复序列（bp）靶位点选择IS1768239随机IS21327415热点IS414281811或12AAAN20TTTIS51195164热点IS10R1329229NGCTNGCNIS50R153199

53、热点IS9031057189未知IS因子的一个共同特征是，在它们的末端都有一段反向的重复序列（IR序列），但其长度并不一定相等。例如IS转位子的左边IR序列是17bp，右边的是22 bp，两者相差5 bp。转位时往往还要复制宿主靶位点的一段DNA（415 bp），形成了位于其两端外侧的一小段同向重复序列。图3.1 IS因子的结构特点IS因子一般只编码一种参与转位作用的转位酶，它能够识别反向重复序列，并催化转位因子发生转位作用，即从原位点上解离下来，然后插入到新的位点上。可以插入到大肠杆菌染色体、质粒以及噬菌体基因组的各个位置上。既可以正向整合到基因组上，也可以反向整合到基因组上3.1.2 转位

54、子（Tn）转位子是由几个基因组成的特定的DNA片段，而且往往带有抗菌素抗性基因，所以易于鉴定。根据结构特征的不同，转位子可分为复合系和Tn3系两种类别。复合转位子是由2个同样的IS因子连接在抗菌素抗性片段两侧构成的。在这些复合单位中，IS因子可以是反向重复的构型，也可以是正向重复的构型。图3.2 复合转座子结构特点图3.3 侧翼IS因子取向不同的两种复合转座子（a）2个IS因子呈反向重复排列；（b）2个IS因子同向重复排列。但无论它们如何取身长，都有不会改变IR序列的排列方向。复合转位子很容易携带着抗菌素抗性基因从细菌染色体转移到质粒或噬菌体基因组上。当发生这种情况时，转位子就会随着这些载体分

55、子迅速地传播到其它细菌中去。这类转位作用是自然界中发生细菌抗药性的主要原因。Tn3系转位子结构比较复杂，长度约为5000bp。末端有一对38 bp的IR序列，但不含有IS因子序列。每个转位子都带有3个基因：一个是编码对氨苄青霉素抗性的-内酰胺酶（-lactamase）基因，另外2个是与转位有关的基因TnpA和TnpR基因。TnpA是转位酶基因，TnpR则编码一小分子蛋白，该蛋白质既能阻遏TnpA基因，又能促进分隔区的位点专一性切割。图3.4 Tn3转座子结构特点3.2 断裂基因许多真核基因的编码序列不是连续排列的，它们往往被一些片段分隔成几个小片段。我们将这种编码序列不连续的的间断基因称为断裂

56、基因。断裂基因最初是在腺病毒（adenovirus）中发现的。在1977年度美国冷泉港实验室学术年会上有人报告，腺病毒基因是断裂基因，以后在SV40病毒和许多真核基因中都发现了断裂基因。除干扰素基因和组蛋白基因之外，断裂基因是所有真核基因的普遍现象。不连续的断裂基因的表达程序是：先转录出包括编码序列和间隔序列在内的原初转录物，即核不均一RNA（hnRNA）；然后经过删除和连接，除去无关的DNA间隔序列转录物，便成为成熟的mRNA分子；它从细胞核中运输到细胞质，再翻译成多肽链。这些在加工成熟过程中被剪除掉的间隔序列又称为间隔子或内含子，被保留下来的编码序列又叫做表达子或外显子。而这种间隔子的删除

57、和表达子的连接过程，称为RNA剪辑。不同的基因中外显子的数目不同，最多的可达40多个，如胶原蛋白的基因。图3.5 人-珠蛋白基因的结构该基因编码成年人血红蛋白-链。所有哺乳动物的-珠蛋白基因都是由被2个间隔子分隔开的3个表达子构成。框内数字表示每个表达子或间隔子的核苷酸数。初级转录本（pre-mRNA）含有表达子和间隔子序列。由剪辑酶切除间隔子，将表达子连接起来；同时经过5端的加“帽子”作用和3端的加poly（A）作用等加工过程，成为成熟的mRNA。外显子和内含子的连接区序列是高度保守的，这一序列提供了RNA加工过程中的剪接信号。序列分析表明，几乎每个内含子5端起始的两个核苷酸都是GT，3端最后的两个核苷酸总是AG。由于这两个核苷酸的高度保守性和存在的广泛性，有人把它称为GT-AG规律。这同时也表明在这些基因中可能存在着一个共同的剪接加工机制。但是在线粒体基因和酵母基因中不存在这类保守序列，暗示还可能存在着不同类型的加工过程。3.3 假基因这是一类核苷酸序列与其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋白质的失活基因。例如，在珠蛋白、免疫球蛋白、组织相容性抗原以