食品微生物学实验指导

1、食 品 微 生 物 学 实 验 指 导(罗军 赖建平)南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系2009年10月前 言食品是人类赖以生存的必要条件。食品安全问题是关系到人的生命健康和社会经济发展的重要问题。据WHO数据估计，全球每年报告食源性疾病发病病例数达十亿例，其中80%由微生物引起。老百姓对食品卫生的要求是越来越高，国家针对食品安全的法制化建设步伐正在加快。1995年正式颁布中华人民共和国食品卫生法，为搞好品卫生工作，保证食品质量提供了法律依据，2007年10月31日，国务院讨论并通过中华人民共和国食品安全法，并于2008年4月20日向社会公布。食品微生物学是食品安全与质量专业的一门专

2、业基础学科，它主要研究食品中有害微生物的形态、结构、致病性、检测和预防，以及有益微生物的应用和发展，为食品生产，食品卫生提供理论依据。而食品微生物学实验课的实施则可提供给学生丰富和加深理论知识，获得感性认识，增强动手能力的机会和场所，同时，通过实验，培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力；实事求是、严肃认真的科学态度以及勤俭节约、爱护公物的良好作风。掌握食品微生物检验技术是食品从业人员和食品卫生监督者的神圣职责；是贯彻执行食品卫生法，提高食品质量必不可少的技术保证；是保证食品安全卫生的重要手段。目前，高校培养的食品安全专业人才，多为生产与加工环节需求的理工科人才，在面对突发公共卫生事件时

3、，普遍缺乏应急反应能力，不能对突发事件做出科学快速的处理，我们根据预防医学食品安全专业学生的培养要求，制订相应的课程培养目标，通过开展食源性疾病检测综合性实验，重点加强学生应急反应能力培养，如接报卫生事件后正确处理能力、根据不同状况采集足够证据能力、现场调查分析能力、流行病调查统计分析数据能力、生物安全防范操作能力、微生物实验检验能力、综合分析报告能力、防止事件扩大化等能力。本教材力求突出应急型公共卫生人才培养特色，以适应社会工作的需求，内容符合“特色、实用、创新”的原则，既注重基本理论和基本技术的系统性，又突出重点，突出实用性。增加了食源性疾病暴发的调查和控制内容，首次将流行病学、卫生法学、

4、食品安全与控制学、卫生管理学等理论实验知识进行整合，侧重于食源性疾病暴发应急处理能力所需基本技能的实际操作与演练。并对食品微生物检验实验室管理内容作了介绍。附录包括培养基、常用试剂、及调查分析的背景资料。由于编者水平有限、时间仓促，书中难免有疏漏与不妥之处，敬请同行和广大读者批评指正。二、学生缺乏面对突发公共卫生事件时的应急反应能力食品微生物学教学，缺乏对学生的应急反应能力的培养，在应对突发公共卫生事件时，三、三、突发公共卫生事件应急能力的培养四、本书的编排本书分六个部分，第一部分是实用准则，简述暴发调查和控制的步骤，重点介绍工作计划和准备、食源性疾病暴发的监测、调查、控制措施和食源性疾病原体

5、的检测。五、实验目的本教材在实验编排上，注重实验的科学性、实用性及连贯性。积极调动学生的能动性，尽量增加学生动手机会，让学生先从掌握培养基的配制和灭菌入手，随后用自己所配制的培养基进行接种分离，通过显微观察获得对微生物的感性认识；通过生化试验、菌落总数测定及大肠菌群测定等试验熟练并掌握食品微生物学的操作和检验技术。此外，还安排学生赴野外进行真菌的采集，初步认识和生态考察，丰富视野。调动学生学习的主动性、积极性、创造性，重视学生能力的培养是当今教学改革的主旋律。作为一名教师，不仅要传授最基本、最核心的理论知识，更重要的是应努力教给学生如何提高能力。能力主要包括自学能力(查阅文献资料能力)、科学思

6、维能力(分析、综合、想象和创造能力)、动手能力(实验设计和基本操作能力)、表达能力(语言、文字、图表及整理统计能力)等。有鉴于此，本书在教学内容改革上作了一些大胆的尝试：一、改变“实验课验证课堂理论”的传统做法，开设综合性实验传统的实验课教学模式是，每讲完一个或几个章节的理论知识后就安排一次实验课，主要是验证课堂理论，而学生真正动手、动脑机会较少，不利于学生能力培养。因此，我们将实验课程独立出来，减少验证性和重复性实验，将以往零散的单一的实验重新编排成实践性、目的性很强的综合性实验，集中时间进行。综合性实验涵盖了要求学生掌握的微生物学基本技能，同时纳入了一些新方法，展示了一次科学实验的全过程，

7、给学生独立设计和完成一个实验的机会，大大增加了学生动手机会。实验结束，要求学生按照科研论文格式撰写实验论文。二、为拓宽学生知识面，启迪思维，精心编写补充教材，主要内容有：1.微生物学基础实验。2.食品微生物学综合性实验。3.研究、创新性实验。4.综合性、研究、创新性实验的实验报告及科研论文的撰写方法。六、因此，针对食源性疾病快速检测技术不断发展，但是，现行培养的公共卫生监督人员，对于食源性疾病的暴发的调查与控制技术还不能全面掌握，因为涉及到临床医学、流行病学、实验医学、食品微生物学、食品化学、食品安全与控制等多方面的技术，这些技术又都是独立的，分割的条块知识，未经整合的实验体系已不能满足突发公

8、共卫生事件时，对学生应急能力的培养要求。本书重点培养学生的应急能力， 的随着科学发展，食品科学领域中微生物的应用也越来越广泛，无论是食品生产、加工、储藏、销售和食用的任一环节，都要求食品专业人员正确掌握微生物学的基本理论和基本操作。近年来，食源性疾病的暴发的调查与控制涉及到多个部门的工作，需要微生物技术发展很快，伴随着许多商品化培养和试剂的推出以及仪器和工具的改进，许多微生物实验方法已从过去繁、费时的工作中解脱出来。本教材除保留现今生产和科研中常应用的一些经典方法和器材外，还补充了近年来推荐和应用的一些方法，比如；将适用于现场检测食品和餐具的快速检测大肠菌群的纸片法与传统方法共同试验和比较；在

9、糖发酵管作比较等。限于编者的水平，本书中错漏在所难免，欢迎广大读者指正，以便再版时改进。编者2006年09月 实验须知微生物学实验课是一门操作技能很强的课程。对每一个微生物学工作者来说，其重要性决不亚于理论课程，两者的关系犹如大鹏的一对强劲翅膀，没有它们间的协同，就无法在广阔的蓝天中自由翱翔。实验课教学的主要目标是，使学生了解食品微生物学主要的研究方法和手段，掌握基本技能和基本原理，树立牢固的无菌观念，更重要的是培养学生自学能力、科学思维能力、动手能力和表达能力。为保证实验效果和实验室的安全，我们根据微生物学实验工作的特点，提出如下几点注意事项：一、学生在实验课前，应充分预习实验内容，明确实验

10、目的，了解实验原理、方法和注意事项。二、进入实验室必须穿白大褂。每次实验前须用湿布擦净台面，并洗手，以减少染菌的机会。尽量不带个人生活、学习用品进入实验室，必须要带的书本、文具等应放在远离实验操作的指定位置。三、严格执行无菌操作，防止杂菌污染。万一遇到盛菌试管或瓶不慎打破而污染皮肤、衣物、桌面等意外情况，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。用过的玻片放入消毒缸内，平板、试管、吸管和废弃的生化微量管应放在指定地点待灭菌处理，不得随意乱放或清洗。四、认真、及时、实事求是地做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果。注意独立思考解决实验中遇到的问题。五、

11、实验过程中，切勿使酒精、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火机。六、每次实验需进行培养的材科，应标明自己的组别及处理方法，放于教师指定的地点进行培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。七、离开实验室前，先用消毒液泡手，再用肥皂洗手，并用清水冲净。打扫好实验室，并注意关好门窗、水电。实验一 普通光学显微镜（一）实验目的了解普通光学显微镜基本构造及原理，掌握显微镜的操作使用。（二）实验原理普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。以往最简单的显微镜仅由几块透镜组成，而当前使用的显微镜由一套透镜组成。普通光学显微镜通常能将物体放大15

12、002000倍。1.显微镜的构造普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一为机械装置，一为光学系统，这两部分很好的配合，才能发挥显微镜的作用。2.显微镜的机械装置显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋等部件（1）镜座  镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件的基础。（2）镜筒  镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间的暗室。从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。镜筒长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而

13、且成像质量也受到影响。因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm，此数字标在物镜的外壳上。（3）物镜转换器  物镜转换器上可安装34个接物镜，一般是三个接物镜（低倍、高倍、油镜）。Nikon显微镜装有四个物镜。转动转换器，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。（4）载物台  载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。（5）推动器  是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的，好的显微镜在纵

14、横架杆上刻有刻度标尺，构成很精密的平面座标系。如果我们须重复观察已检查标本的某一部分，在第一次检查时，可记下纵横标尺的数值，以后按数值移动推动器，就可以找到原来标本的位置。（6）粗动螺旋  粗动螺旋是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件，老式显微镜粗螺旋向前扭，镜头下降接近标本。新近出产的显微镜（如Nikon显微镜）镜检时，右手向前扭载物台上升，让标本接近物镜，反之则下降，标本脱离物镜。（7）微动螺旋  用粗动螺旋只可以粗放的调节焦距，要得到最清晰的物象，需要用微动螺旋做进一步调节。微动螺旋每转一圈镜筒移动0.1毫米（100微米）。新近出产的较高档次的显微镜的粗动螺旋和微动

15、螺旋是共轴的。3.显微镜的光学系统显微镜的光学系统由反光镜，聚光器，接物镜，接目镜等组成，光学系统使物体放大，形成物体放大像 。（1）反光镜  较早的普通光学显微镜是用自然光检视物体，在镜座上装有反光镜。反光镜是由一平面和另一凹面的镜子组成，可以将投射在它上面的光线反射到聚光器透镜的中央，照明标本。不用聚光器时用凹面镜，凹面镜能起会聚光线的作用。用聚光器时，一般都用平面镜。新近出产的较高档次的显微镜镜座上装有光源，并有电流调节螺旋，可通过调节电流大小调节光照强度。（2）聚光器  聚光器在载物台下面，它是由聚光透镜、虹彩光圈和升降螺旋组成的。聚光器可分为明视场聚光器和暗视场聚

16、光器。普通光学显微镜配置的都是明视场聚光器，明视场聚光器有阿贝聚光器、齐明聚光器和摇出聚光器。阿贝聚光器在物镜数值孔径高于0.6时会显示出色差和球差。齐明聚光器对色差、球差和慧差的校正程度很高，是明视场镜检中质量最好的聚光器，但它不适于4倍以下的物镜。摇出聚光器能将聚光器上透镜从光路中摇出满足低倍物镜（4×）大视场照明的需要。聚光器安装在载物台下，其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，以得到最强的照明，使物象获得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以调节，使焦点落在被检物体上，以得到最大亮度。一般聚光器的焦点在其上方1.25mm处，而其上升限度为载物台平面下方0.1mm。因此，要

17、求使用的载玻片厚度应在0.81.2mm之间，否则被检样品不在焦点上，影响镜检效果。聚光器前透镜组前面还装有虹彩光圈，它可以开大和缩小，影响着成像的分辨力和反差，若将虹彩光圈开放过大，超过物镜的数值孔径时，便产生光斑；若收缩虹彩光圈过小，分辨力下降，反差增大。因此，在观察时，通过虹彩光圈的调节再把视场光阑（带有视场光阑的显微镜）开启到视场周缘的外切处，使不在视场内的物体得不到任何光线的照明，以避免散射光的干扰。（3）物镜  安装在镜筒前端转换器上的接物透镜利用光线使被检物体第一次造像，物镜成像的质量，对分辨力有着决定性的影响。物镜的性能取决于物镜的数值孔径（numerical apea

18、ture简写为NA），每个物镜的数值孔径都标在物镜的外壳上，数值孔径越大，物镜的性能越好。物镜的种类很多，可从不同角度来分类：根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同，可分为：干燥系物镜  以空气为介质，如常用的40×以下的物镜，数值孔径均小于1。油浸系物镜  常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜头，其放大率为90×100×，数值孔值大于1。根据物镜放大率的高低，可分为：低倍物镜  指1×6×，NA值为0.040.15；中倍物镜  指6×25×，NA值为0.15 0.40；高倍物镜 

19、; 指25×63×，NA值为0.350.95；油浸物镜  指90×100×，NA值为1.251.40。根据物镜像差校正的程度来分类可分为：消色差物镜  是最常用的物镜，外壳上标有“Ach”字样，该物镜可以除红光和青光形成的色差。镜检时通常与惠更斯目镜配合使用。复消色差物镜  物镜外壳上标有“Apo”字样，除能校正红、蓝、绿三色光的色差外，还能校正黄色光造成的相差，通常与补偿目镜配合使用。特种物镜  在上述物镜基础上，为达到某些特定观察效果而制造的物镜。如：带校正环物镜，带视场光阑物镜，相差物镜，荧光物镜，无应变物镜

20、，无罩物镜，长工作距离物镜等。目前在研究中常用的物镜还有：半复消色差物镜（FL），平场物镜(Plan)，平场复消色差物镜（Plan Apo）,超平场物镜（Splan，超平场复消色差物镜（Splan Apo）等。（4）目镜  目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，并把物像映入观察者的眼中。目镜的结构较物镜简单，普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成，上端的一块透镜称“接目镜”，下端的透镜称“场镜”。上下透镜之间或在两个透镜的下方，装有由金属制的环状光阑或叫“视场光阑”，物镜放大后的中间像就落在视场光阑平面处，所以其上可安置目镜测微尺。普通光学显微镜常用的目镜为惠更斯目镜（Huyge

21、ns eyepiece），如要进行研究用时，一般选用性能更好的目镜，如补偿目镜（K）、平场目镜（P）、广视场目镜（WF）。照相时选用照相目镜（NFK）。4.光学显微镜的成像原理显微镜的放大是通过透镜来完成的，单透镜成像具有像差，影响像质。由单透镜组合而成的透镜组相当于一个凸透镜，放大作用更好。是显微镜的成像原理模式。AB为标本    5.显微镜的性能显微镜分辨能力的高低决定于光学系统的各种条件。被观察的物体必须放大率高，而且清晰，物体放大后，能否呈现清晰的细微结构，首先取决于物镜的性能，其次为目镜和聚光镜的性能。（1）数值孔径 也叫做镜口率（或开口率），简写为N.

22、A，在物镜和聚光器上都标有它们的数值孔径，数值孔径是物镜和聚光器的主要参数，也是判断它们性能的最重要指标。数值孔径和显微镜的各种性能有密切的关系，它与显微镜的分辨力成正比，与焦深成反比，与镜象亮度的平方根成正比。数值孔径可用下式表示：N.A=n.sin2式中：n物镜与标本之间的介质析射率物镜的镜口角所谓镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度。镜口角总是小于180°。因为空气的折射率为1，所以干燥物镜的数值孔径总是小于1，一般为0.050.95；油浸物镜如用香柏油（折射率为1.515）浸没，则数值孔径最大可接近1.5。虽然理论上数值孔径的极限等于所用

23、浸没介质的折射率，但实际上从透镜的制造技术看，是不可能达到这一极限的。通常在实用范围内，高级油浸物镜的最大数值孔径是1.4。几种物质的介质的折射率如下：空气为1.0，水为1.33，玻璃为1.5，甘油为1.47，香柏油为1.52。介质折射率对物镜光线通路的影响见。（2）分辨力D可用下式表示：D=/2N.A.可见光的波长为0.40.7微米，平均波长为0.55微米。若用数值孔为0.65的物镜，则D=0.55微米/2×0.65=0.42微米。这表示被检物体在0.42微米以上时可被观察到，若小于0.42微米就不能视见。如果使用数值孔径为1.25的物镜，则D=2.20微米。凡被检物体长度大于这个

24、数值，均能视见。由此可见，D值愈小，分辨力愈高，物象愈清楚。根据上式，可通过：（1）减低波长；（2）增大折射率；（3）加大镜口角来提高分辨力。紫外线作光源的显微镜和电子显微镜就是利用短光波来提高分辨力以检视较小的物体的。物镜分辨力的高低与造象是否清楚有密切的关系。目镜没有这种性能。目镜只放大物镜所造的象。（3）放大率显微镜放大物体，首先经过物镜第一次放大造象，目镜在明视距离造成第二次放大象。放大率就是最后的象和原物体两者体积大小之比例。因此，显微镜的放大率（V）等于物镜放大率（V1）和目镜放大率（V2）的乘积，即：V=V1×V2比较精确的计算方法，可从下列公式求得M=×DF

25、1F2F1=接物镜焦距，F2=接目镜焦距  =光学筒长，D=明视距离（=250毫米）=接物镜的放大倍数D=接目镜放大倍数M=显微镜放大倍数F1F2设=160毫米   F1=4毫米  D=250毫米  F2=150毫米则M=×D=160×250=40×16.7=668倍F1F2415（4）焦深在显微镜下观察一个标本时，焦点对在某一象面时，物象最清晰，这象面为目的面。在视野内除目的面外，还能在目的面的上面和下面看见模糊的物象，这两个面之间的距离称为焦深。物镜的焦深和数值孔径及放大率成反比：即数值孔径和放大率愈大，焦深愈

26、小。因此调节油镜比调节低倍镜要更加仔细，否则容易使物象滑过而找不到。6.显微镜的使用操作及注意事项显微镜结构精密，使用时必须细心，要按下述操作步骤进行。（1）观察前的准备1.显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。2.将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约10cm左右，右侧可放记录本或绘图纸。3.调节光照 不带光源的显微镜，可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照，但不能用直射阳光，直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。将10×物镜转入光孔，将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置，用左眼观察目镜中视野的亮度，转动反光镜，使视野的光照达

27、到最明亮最均匀为止。光线较强时，用平面反光镜，光线较弱时，用凹面反光镜。自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。4.调节光轴中心 显微镜在观察时，其光学系统中的光源、聚光器、物镜和目镜的光轴及光阑的中心必须跟显微镜的光轴同在一直线上。带视场光阑的显微镜，先将光阑缩小，用10×物镜观察，在视场内可见到视场光阑圆球多边形的轮廓像，如此像不在视场中央，可利用聚光器外侧的两个调整旋钮将其调到中央，然后缓慢地将视场光阑打开，能看到光束向视场周缘均匀展开直至视场光阑的轮廓像完全与视场边缘内接，说明光线已经合轴。（2）低倍镜观察  镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯

28、。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒（或下降载物台），直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。（3）高倍镜观察  在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的，在正常情况下，高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片。若使用不同型号的物镜，在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调节光照，使亮度适

29、中，缓慢调节粗调节旋钮，使载物台上升（或镜筒下降），直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观察的部位，并移至视野中央进行观察。（4）油镜观察  油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。使用油镜按下列步骤操作：1.先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出。2.在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。3.从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，（或镜筒下降），使油浸物镜浸入香柏油

30、中，使镜头几乎与标本接触。4.从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光器，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上升），当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。5.观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液（乙醚2份，纯酒精3份）或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭23下即可，（注意向一个方向擦拭）。6.将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将镜筒下降至最低，降

31、下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用一个干净手帕将接目镜罩好，以免目镜头沾污灰尘。最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。实验二 相差显微镜（一）实验目的了解相差显微镜基本构造及原理，掌握相差显微镜的操作使用。（二）实验原理1.相差显微镜的特点 相差显微镜是一种将光线通过透明标本细节时所产生的光程差（即相位差）转化为光强差的特种显微镜。光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化。因此，用普通光学显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。然而，由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的

32、光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人的肉眼感觉不到，但相差显微镜能通过其特殊装置环状光阑和相板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强，使我们能比较清楚的观察到普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。2.相差显微镜的成像原理 镜检时光源只能通过环状光阑的透明环，经聚光器后聚成光束，这束光线通过被检物体时，因各部分的光程不同，光线发生不同程度的偏斜（衍射）。由于透明圆环所成的像恰好落在物镜后焦点平面和相板上

33、的共轭面重合。因此，未发生偏斜的直射光便通过共轭面，而发生偏斜的衍射光则经补偿面通过。由于相板上的共轭面和补偿面的性质不同，它们分别将通过这两部分的光线产生一定的相位差和强度的减弱，两组光线再经后透镜的会聚，又复在同一光路上行进，而使直射光和衍射光产生光的干涉，变相位差为振幅差。这样在相差显微镜镜检时，通过无色透明体的光线使人眼不可分辨的相位差转化为人眼可以分辨的振幅差（明暗差）。3.相差显微镜的结构和装置  相差显微镜与普通光学显微镜的基本结构是相同的，所不同的是它具有四部分特殊结构：即环状光阑、相板、合轴调节望远镜及绿色滤光片。（1）环状光阑  具有环形开孔的光阑。位于

34、聚光器的前焦点平面上，光阑的直径大小是与物镜的放大倍数相匹配的，并有一个明视场光阑，与聚焦器一起组成转盘聚光器。在使用时只要把相应的光阑转到光路即可。（2）相板  位于物镜内部的后焦平面上。相板上有两个区域，直射光通过的部分叫“共轭面”，衍射光通过的部分叫“补偿面”。带有相板的物镜叫相差物镜，常以“Ph”字样标在物镜外壳上。相板上镀有两种不同的金属膜：吸收膜和相位膜。吸收膜常为铬、银等金属在真空中蒸发而镀成的薄膜，它能把通过的光线吸收掉60%93%，相位膜为氟化镁等在真空中蒸发镀成，它能把通过的光线相位推迟1/4波长。根据需要，两种膜有不同的镀法，从而制造出不同类型的相差物镜。如果吸

35、收膜和相位膜都镀在相反的共轭面上，通过共轭面的直射光不但振幅减弱，而且相位也被推迟1/4，衍射光因通过物体时相位也被推迟1/4，这样就使得直射光与衍射光维持在同一个相位上。根据相长干涉原理，合成光等于直射光与衍射光振幅之和，因背景只有直射光的照明，所以通过被检物体的合成光就比背景明亮。这样的效果叫负相差，镜检效果是暗中之明。如果吸收膜镀在共轭面，相位膜镀在补偿面上，直射光仅被吸收，振幅减少，但相位未被推迟，而通过补偿面的衍射光的相位，则被推迟了两个1/4，因此衍射光的相位要比直射光相位落后1/2。根据相消干涉原理，这样通过被检物体的合成光要比背景暗，这种效果叫正相差，即镜检效果是明中之暗。负相

36、差物镜（Negativecontrast）用缩写字母“N”表示，正相差物镜（Positive  contrast）用缩写字母“P”表示，由于吸收膜对通过它的光线的透过率不同，可分为高、中、低及低低，如Olympus光的透过率分为：7%、15%、20%、40%四个等级，因此分为高（High略写为H），中（Medium略写为M），低（Low略写为L）及低低（LowLow略写成LL）四类，构成了负高（NH）、负中（NM）、正低（PL）和正低低（PLL）四种类型相差物镜，这些字母符号都写在相差物镜的外壳上。可根据被检物体的特性来选择使用不同类型的相差物镜。（3）合轴调节望远镜  是

37、相差显微镜一个极为重要的结构。环状光阑的像必须与相板共轭面完全吻合，才能实现对直射光和衍射光的特殊处理。否则应被吸收的直射光被泄掉，而不该吸收的衍射光反被吸收，应推迟的相位有的不能被推迟，这样就不能达到相差镜检的效果。由于环状光阑是通过转盘聚光器与物镜相匹配的，因而环状光阑与相板常不同轴。为此，相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜（在镜的外壳上标有“CT”符号），用于合轴调节。使用时拨去一侧目镜，插入合轴调节望远镜，旋转合轴调节望远镜的焦点，便能清楚看到一明一暗两个圆环。再转动聚光器上的环状光阑的两个调节钮，使明亮的环状光阑圆环与暗的相板上共轭面暗环完全重叠。如明亮的光环过小或过大，可调节聚光器

38、的升降旋钮，使两环完全吻合。如果聚光器已升到最高点或降到最低点而仍不能矫正，说明玻片太厚了，应更换。调好后取下望远镜，换上目镜即可进行镜检观察。（4）绿色滤光片  由于使用的照明光线的波长不同，常引起相位的变化，为了获得良好的相差效果，相差显微镜要求使用波长范围比较窄的单色光，通常是用绿色滤光片来调整光源的波长。Olympus厂家生产的相差显微镜在镜检时要使用该厂规定的IF550绿色滤光片作为配套器件。4.相差显微镜的使用范围、操作步骤及注意事项（1）使用范围  相差显微镜能观察到透明样品的细节，适用于对活体细胞生活状态下的生长、运动、增殖情况及细微结构的观察。因此，是微生

39、物学、细胞生物学、细胞和组织培养、细胞工程、杂交瘤技术等现代生物学研究的必备工具。（2）操作步骤 根据观察标本的性质及要求，挑选适合的相差物镜。将标本片放到载物台上。进行光轴中心的调整。取下一侧目镜，换上合轴调节望远镜，调整环状光阑与相板上的共轭面圆环完全重叠吻合，然后取下合轴调节望远镜，换回目镜。在使用中，如需要更换物镜倍数时，必须重新进行环状光阑与相板共轭面圆环吻合的调整。放上绿色滤光片，即可进行镜检，镜检操作与普通光学显微镜方法相同。（3）注意事项视场光阑与聚光器的孔径光阑必须全部开大，而且光源要强。因环状光阑遮掉大部分光，物镜相板上共轭面又吸收大部分光。不同型号的光学部件不能互换使用。

40、载玻片、盖玻片的厚度应遵循标准，不能过薄或过厚。切片不能太厚，一般以510m为宜，否则会引起其他光学现象，影响成像质量。实验三  微生物的分离、纯化和接种一、微生物的分离、纯化 （一）实验目的 1.了解微生物分离和纯化的原理，2.掌握常用的分离纯化微生物的方法 （二）实验原理 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 微生物在

41、固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不

42、同类型的微生物。（三）实验材料1.培养基  淀粉琼脂培养基(高氏I号培养基)，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。2.溶液或试剂 10%酚液，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。3.仪器或其它用具 无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板、涂布器等。（四）实验方法倒平板制备梯度稀释液涂布（或划线法）培养挑单菌落保存。1.稀释涂布平板法（1）倒平板 将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基加热溶化待冷至5560时，高氏I号琼脂培养基中加入10%酚数

43、滴，马丁氏培养中加入链霉素溶液(终浓度为30g/ml)，混合均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。（2）制备土壤稀释液 称取土样l0g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将细胞分散。用一支lml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管

44、中吸取lml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液，注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管。 （3）涂布将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5和10-6三种稀度，然后用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6 三管土壤稀释液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。用无菌玻璃涂棒，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5l0min，使菌液浸入培养基。（4）培养将高

45、氏I号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28温室中培养35d，肉膏蛋白胨平板倒置于37温室中培养23d。（5）挑菌落将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基斜面上，分别置28和37温室培养。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。（6）平板划线分离法 倒平板 按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期。 划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-l的土壤悬液一环在平板上划线。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板

46、培养基的一边作第一次平行划线34条，再转动培养皿约70度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。 挑菌落 同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。 结果判定 （五）实验思考1.所做涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是，请分析其原因并重做。2.在三种不同的平板上你分离得到哪些类群的微生物？简述它们的菌落特征。二、微生物的接种技术（一）实验目的 1.学习掌握微生物的几种接种技术2.建立无

47、菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节（二）实验原理将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定以及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。接种的关键是要严格的进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果就不可靠，影响下一步工作的进行。（三）实验器材1.器械和用品 酒精灯，玻璃铅笔，火柴，试管架、接种环、接种针、接种钩、滴管、移液管、三角型接种棒等接种工具。2.菌种和培养基菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus&

48、#160;aureus）。培养基：普通琼脂斜面和平板,营养肉汤,普通琼脂高层(直立柱)。（四）实验方法斜面接种法液体接种法固体接种法穿刺接种法。1.斜面接种法斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种。 通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面，肉汤中的纯培养物接种到斜面培养基上。操作应在无菌室、接种柜或超净工作台上进行，先点燃酒精灯。将菌种斜面培养基(简称菌种管)与待接种的新鲜斜面培养基(简称接种管)持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，菌种管在前，接种管在后，斜面向上管口对齐，应斜持试管呈450度角，并能清楚地看到两个试管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿

49、培养基表面。以右手在火焰旁转动试管棉塞，使其松动，以便接种时易于取出。 右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。镍铬丝部分（环和丝）必须烧红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底。用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。棉塞应始终夹在手中如掉落应更换无菌棉塞。 将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再从斜面上刮取少许菌苔取出，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管。在试管中由下往上做S形划线。接种完毕，接种环应通过火焰抽出管

50、口，并迅速塞上棉塞。再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧棉塞。将接种管贴好标签或用玻璃铅笔划好标记后再放入试管架，即可进行培养。2.液体接种法 多用于增菌液进行增菌培养，也可用纯培养菌接种液体培养基进行生化试验，其操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同，仅将不同点介绍如下： 由斜面培养物接种至液体培养基：用接种环从斜面上沾取少许菌苔，接至液体培养基时应在管内靠近液面试管壁上将菌苔轻轻研磨并轻轻振荡，或将接种环在液体内振摇几次即可。如接种霉菌菌种时，若用接种环不易挑起培养物时，可用接种钩或接种铲进行。 由液体培养物接种液体培养基时，可用接种环或接种针沾取少许液体移至新液体培养基即可。也可根据

51、需要用吸管、滴管或注射器吸取培养液移至新液体培养基即可。 接种液体培养物时应特别注意勿使菌液溅在工作台上或其他器皿上，以免造成污染。如有溅污，可用酒精棉球灼烧灭菌后，再用消毒液擦净。凡吸过菌液的吸管或滴管，应立即放入盛有消毒液的容器内。3.固体接种法 普通斜面和平板接种均属于固体接种，斜面接种法已讲了，不再赘述。固体接种的另一种形式是接种固体曲料，进行固体发酵。按所用菌种或种子菌来源不同可分为：用菌液接种固体料，包括用菌苔刮洗制成的菌悬液和直接培养的种子发酵液。接种时按无菌操作将菌液直接倒入固体料中，搅拌均匀。但要注意接种所用水容量要计算在固体料总加水量之内，否则会使接种后含水量加大

52、，影响培养效果。 用固体种子接种固体料。包括用孢子粉、菌丝孢子混合种子菌或其他固体培养的种子菌。将种子菌于无菌条件下直接倒入无菌的固体料中即可，但必须充分搅拌使之混合均匀。一般是先把种子菌和少部分固体料混匀后再拌大堆料。4.穿刺接种法 此法多用于半固体、醋酸铅、三糖铁琼脂与明胶培养基的接种，操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同。但必须使用笔直的接种针，而不能使用接种环。接种柱状高层或半高层斜面培养管时，应向培养基中心穿刺，一直插到接近管底，再沿原路抽出接种针。注意勿使接种针在培养基内左右移动，以使穿刺线整齐，便于观察生长结果。5.结果 分别记录并描绘平板划线、斜面和半固体接种的微生

53、物生长情况和培养特征。（五）实验思考1.如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。2.为什么高氏I号培养基和马丁氏培养基中要分别加入酚和链霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为应如何做？3.试述如何在接种中，贯彻无菌操作的原则? 4.以斜面上的菌种接种到新的斜面培养基为例说明操作方法和注意事项。5.试设计一个实验，从土壤中分离酵母菌并进行计数。实验四 细菌的简单染色和革兰氏染色（一）实验目的学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法。（二）实验原理用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。

54、因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染

55、色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。（三）实验器材1.活材料：培养12-16h的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis），培养24h的大肠杆菌

56、（Escherichia coli）2.染色液和试剂：结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红、复红、二甲苯、香柏油3.器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜（四）实验方法1.简单染色（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的苏云金杆菌浓菌液挑2-3环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。（2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过

57、火焰2-3次固定（以不烫手为宜）（4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min。（5）水洗：用水洗去涂片上的染色液（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。（7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。2.革兰氏染色（1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。（2）晾干：与简单染色法相同。（3）固定，与简单染色法相同（4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1min。（5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。（6）媒染：滴加卢哥氏

58、碘液，媒染1min。（7）水洗：用水洗去碘液。（8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色2025s至流出液无色，立即水洗。（9）复染：滴加蕃红复染5min。（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。（11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。（12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。（13）实验完毕后的处理：将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦23次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦23次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。（五）实验思考给出Bacillus thuringiensis和Escherichia coli的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。（六）注意事项1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如