分子杂交原理及探针制备

1、分子杂交原理及探针制备一、分子杂交基本原理 1953年，Watson和Crick提出了著名的DNA双螺旋结构学说。DNA这一线性的高分子化合物靠一些非共价键折迭形成三维空间构象。这些非共价键都是比较弱的键，易受外力的作用而断裂，导致空间构象的破坏，使有规则构型的DNA变成不规则的线团，此过程称为DNA变性。DNA变性时，维系双链的氢键也发生断裂而形成两条互补的单链DNA。引起核酸变性的因素有酸、碱、热、某些变性剂（如尿素、甲酰胺等）和某些有机溶剂都可引起DNA变性。 根据DNA变性的程度与温度的关系，可绘制融解曲线。变性的DNA达到总量1/2时的温度称为融解温度（Tm）。Tm值受溶液中离子的种

2、类、离子强度、DNA中碱基组成的均一性以及G-C碱基对含量等因素的影响。 变性的DNA两条互补单链，在适当重新缔合成双链的过程为DNA复性或退火。复性后两条单链又重新按照碱基互补的原则结合起来，形成双螺旋结构，其理化性质和部分生物活性恢复。 两条DNA单链之间能否复性，并不取决于这两条链是否同源，而取决于它们的碱基序列是否互补。如果两条来源不同的DNA单链具有互补的碱基序列，也同样可以复性形成一个杂交体，这个过程即杂交，或称分子杂交。 RNA的化学组成与DNA相似，也有碱基、戊糖和磷酸三种成分，所不同的是戊糖为核糖，碱基中尿嘧啶（U）代替胸腺嘧啶（T），其他三种碱基与DNA分子中的相同。分子杂

3、交不仅可发生在两条DNA单链之间，而且也可发生在具有互补碱基的DNA和RNA片段之间，或RNA与RNA片段之间，即有DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。 分子杂交是在一定条件下以变性DNA或RNA单链作模板，另一DNA或RNA单股寡核苷酸与其碱基互补而生成杂交复合体的过程。二、基因探针 探针广义上是指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子，例如抗原-抗体、生物素-亲和素等均可看成是探针与靶分子的相互作用。基因探针是指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记（同位素或非同位素标记）的核苷酸链。由于基因探针已与核酸样

4、品中具有互补序列的核酸片段退火杂交。因此已广泛用于基因克隆筛选、酶切图谱制作、基因突变、DNA序列分析以及某些临床诊断等方面。（一）基因探针种类和选择基因探针是分子杂交中用于样品特定的DNA或mRNA序列定位的关键物质。根据来源与性质不同已分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、cRNA探针和人工合成的寡核苷酸探针等5类。选择探针的原则是要有高度特异性，其次也需考虑制备探针难易性和检测手段的灵敏性等其他因素。2. 探针的选择 一般探针越长，杂交作用越强，其专一性也越强。但自动合成仪合成的探针最适长度常有一个上限，约为50bp。三、基因探针标记方法（一）、标记物 探针标记物有放射性同位素

5、和非放射标记物两大类。1. 放射性同位素 放射性特同位素标记物是目前应用最多的，因其灵敏度高，已标测到10-1410-18g物质。此外放射性同位素与相应的元素具有完全相同的化学性质。因此对各种酶促反应无任何影响，且不会影响碱基配对的特异性、稳定性及杂交性质。由于标记探针具有放射性，故标记反应可用闪烁记数器监测；杂交信号用敏感性高的放射自显影技术标测，信号的强弱通过计数银粒的多少易于进行定量分析。主要缺点是射线对人体有伤害作用，操作时需要有一定 的防护措施，放射性物质需要特殊的处理以及常用放射性核素的半衰期短不宜存放使用。2. 非放射性标记物 由于放射性同位素标记探针的局限性，人们一直在寻找非放

6、射性标记物，目前常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）和生物素（biotin）。虽非放射性标记探针的敏感性不如同位素标记，但其稳定性和分辨率更高，且标测时间短、操作简便，不需特殊的防护设备，更重要的是不存在放射性污染。似有取代放射性同位素标记物的趋势。三、标记法 探针标记法有酶反应法和化学反应法两大类，但以酶反应法较常用。1. 切口平移法 切口平移标记法先由胰DNA酶I在DNA双链上随机切口，大肠杆菌DNA聚合酶I作用以切口处开始，以另一条DNA链为模板，以4种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口水解5端核苷酸和3端修复加入标记核苷酸同时进行，切口平行推移，可均一标记DNA链。2. 引物延

7、伸法 本法与切口平移法相似，都是利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新的DNA链。由于DNA聚合必须从具有3-OH的末端开始合成，因此与切口平移不同，引物延伸法需要一段与模序列互补的寡聚核苷酸作引物，将它与模板杂交，以提供3-OH端。3. 末端标记法 末端标记法是将标记法导入线型DNA或RNA的5端或3端的一类标记法。（1） 5端标记法 T4多聚合苷酸激酶能（2） 3端标记法 T4DNA聚合酶4. 体外转录法分子杂交技术分子杂交大致可分为液相杂交和固相杂交两类。一、 液相分子杂交 液相分子杂交是最早使用的方法。其原理是将参加液相杂交的两条核酸链都游离在溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度、温度、

8、时间等）进行杂交，然后再将未杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分子。二、 固相分子杂交固相分子杂交是将带册的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，而标记的探针则游离在溶液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固相杂交。其可通过漂洗能将未杂交的游离探针除去，留在膜上的杂交分子容易被检测，能防止靶DNA的自我复性，故被广泛应用。1. Southern印迹杂交 膜上检测DNA的杂交技术，1975年由Edwin Southern建立。利用这一技术可进行克隆基因DNA的酶切图谱分析，基因组中某一基因的定性与定量分析、基因点突变及限制性片段长度多态性分性等。（1）Southern毛细管印迹法 将适量

9、待测DNA样品经限制性内切酶降解，琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，碱处理使凝胶中的DNA变成单链，然后利用毛细管虹吸原理使凝胶中的DNA转移至硝酸纤维素薄膜上，因本法转印效率不高，目前，采用快速、简便、转印效率高的电转印和真空转印等。（2）杂交 转移至固相膜载体上的DNA片段可通过与探针杂交进行检测分析。2. Northern印迹杂交 是应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术，由Alwine于1977年建立，后经Thomas等人改进，主要用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小，其方法类似于Southern印迹杂交。二、原位杂交 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对其实行检测的方法称为原位杂交（hybridization in situ)。 根据所用的探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。根据探针的标记物是否能直接被检测，原位杂交可分为直接法和间接法两种。直接法原位杂交，探针与组织细胞内靶核酸所形成的杂交体不经免疫组织化学即可直接显示。反之，间接原位杂交一般都用半抗原标记探针，而探针与组织内靶核酸所形成的杂交体则通过免疫组织化学对半抗原的定位间接地显示。 原位杂交技术不需要从组织中提取核酸。仅要求将细胞或石蜡包埋的组织切片、活组织的切片置于载玻片上，固定，加甲酰胺等使核酸变性后，可