气体硫化氢分子的血管生物学进展(全文)

1、气体硫化氢分子的血管生物学进展（全文）产H2S的有三种酶，胱硫醚B -合成酶（CBS）、细胞胱硫醚-y裂解酶（CTH/CSE ）和3-巯基丙酮酸转硫酶（3MST ）。CBS和CSE参与从同 型半胱氨酸到半胱氨酸的互变过程，即转硫作用的通路；两种酶都依赖于5-磷酸吡哆醛。同时请注意，CBS和CSE也催化了一系列并不产生 H2S 的额外反应。 CBS 是已知唯一的含亚铁血红素辅基和阳性变构激活剂 S- 腺苷甲硫氨酸的一种 PLP依赖性酶。在静息状态下， CBS和3MST被发 现于线粒体和胞质中，而 CSE 仅存于胞质中。所有三种产 H2S 的酶均在血管细胞中有表达， 但对调控其表达的分子 通路却知

2、之甚少。活性氧和层流剪切流已被证实可以增强 CSE 和 3MST 的表达，而钙和特化蛋白1（ Sp1 ）的升高会上调平滑肌细胞（SMC ）中 CSE的表达。大多数有关血管的研究集中于 CSE，原因是CSE的药物抑制 剂更易获得。另外，CBS缺乏小鼠的出现早于 CSE敲除鼠数年，它们的严 重表型导致生命的第一周就发生死亡，限制了其在实验研究中的应用，致 使研究者后来使用杂合子。相反，CSE敲除小鼠没有发育异常，生命周期相对正常，确实展现了心血管表型，血压升高、内皮依赖性应答减弱。虽 然 3MST 小鼠也可获得，但尚无心血管特征方面的数据发表。H2S 信号转导中即时 vs 延迟的效应和通路H2S是

3、高度水溶性的，在身体常温下的溶解度达80mM。它也溶于脂膜，能进入胞内和胞外的靶蛋白。因为H2S是弱酸性，它在正常体温下与其阴离子HS?达到平衡（pKa : 7），生理性pH值中70%以HS?形式 存在。与H2S生物学活性有关的分子化学属性仍有待阐释，H2S、HS?、聚硫化物和S/N杂合子影响着多种与生物学应答有关的信号通路。靶通路包括激酶和磷酸酶、外加酶、离子通道和转录因子（图 1） o H2S影响信 号蛋白活性的原发机制是靶蛋白上反应的半胱氨酸残留物发生过硫化作 用，形成过硫化物（一SSH）。取决于靶蛋白的性质，H2S的效应可能需 要数秒到数天才能表现出来。例如，ATP敏感（KATP ）通

4、道的过硫化效应导致SMC数秒之内发生超极化和松弛效应，而Keap-1的过硫化反应激活Nf-2和增强抗氧化剂基因表达的过程，需要数小时到数天。卫心jiwd 哒 tiIT-dunhi-k晶rwk |皿Kir ti H >rha«irwHi齐0 叭列踏 r&C (urttiKwl) i£C (畅曲吐Twt 2 叭W»hp 艸E何“孟旦翱 * KmfW 轴lww#ibiW ffflNfiion d*Won"i.i口tn*申intiitMkancif图1 H2S发挥效应的时间轴。即刻效应包括离子通道、 激酶和其他酶 类的激活/抑制效应，暴露于H2S数

5、秒到数分钟可发生。慢性效应依赖于 基因表达和涉及到改变的转录因子活性，虽然转录因子的激活/抑制效应可 能发生于H2S作用后的数分钟至数小时，但观察到生物学效应需要数天 值得注意的是磷酸化是继发于激酶的激活或磷酸酶的抑制，通过过硫化反 应或其他机制。有关 H2S 对半胱氨酸底物的巯基修饰导致功能性改变最早由Mustafa 报道，其团队发现 Cys150 的过硫化反应增强了甘油醛脱氢酶 (GAPDH )的活性， 肝脏匀浆中高达 25%的蛋白质为内源性过硫化产物， 提示硫化作用广泛存在于信号转导中。但数年之后， Jarosz 及同事并不能 重复过硫化反应激活 GAPDH 的实验结果，却观察到 H2S

6、 修饰后酶的活 性下降。因此 H2S 修饰 GAPDH 在调控细胞功能方面的作用尚不明确。近来其他靶点的过硫化反应被发现也与细胞功能改变有关。三磷酸肌 醇受体(IP3R )过硫化反应后能抑制钙离子的释放，产生了 H2S介导的气道舒张作用。 H2S 修饰丝裂原活化蛋白激酶( MEK1 )，改善 DNA 损 伤修复并通过活化 PARP-1 减缓衰老进程。 KIR and IKCa 钾离子通道、 线粒体蛋白、细胞色素 P450酶、NF- kB和PTEN也都被发现可作为硫 化作用的靶点， 提示硫化修饰广泛存在于细胞调控。 对大多数 H2S 修饰来 说，过硫化反应是受抑制的， 但也有几个例外， 包括早期

7、由 Mustafa 等报 道的过硫化反应后 GAPDH 活性增加， 以及最近发现的人类脐静脉内皮细 胞( HUVECs ) MEK1 活性增加。 H2S 信号转导中过硫化反应所扮演的角 色很大程度上取决于观察所见，即采用二硫苏糖醇或其他还原剂逆转了H2S 的过硫化效应。另外，半胱氨酸变异研究进一步提示 H2S 作用于半 胱氨酸底物包括 MEK1 中的 Cys341 ，作为 H2S 介导的 ERK1/2 磷酸化和 转位中的介质，或作用于Cys139，激活PPAR- 丫活性和转位至细胞核。后 者的研究中， 接受高脂肪饮食的小鼠经 H2S 处理后，能免于发展为胰岛素 抵抗和肝脏损伤，提示 H2S 在

8、高脂肪膳食的代谢影响下具有保护性作用。有趣的是，高脂肪膳食下调 CSE的表达，2型糖尿病患者的尿硫酸盐分析 提示与肾小球滤过率（eGFR）强烈相关，提示肾产 H2S与糖尿病肾保护 作用有关。过硫化反应能被硫氧还蛋白系统所逆转。研究发现呼吸暂停患者的硫 氧还蛋白系统被上调，提示上调硫氧还蛋白系统在呼吸暂停或其他高氧化 应激情况下能修饰 H2S 介导的信号通路。 最近的研究发现硫氧还蛋白裂解 过硫化物部分会导致释放 H2S，提示过硫化蛋白质可以是循环系统中H2S的内源性来源。NO/cGMP 信号通路代表着另一种 H2S 发挥生物学功能的信号转导 机制。 H2S 被证实可以抑制 PDE 活性和增加平

9、滑肌细胞的 cGMP 。 H2S 影响 NO/cGMP 通路的其他途径包括 1）增强 eNOS 活化点 S1177 的磷 酸化；2）稳定 eNOS 的二聚活化型； 3）调控可溶性鸟苷酸环化酶 （sGC） 氧化还原态，使 sGC 向亚铁（ NO 应答型）转化。虽然 H2S 对 sGC 和磷 酸二酯酶5型（PDE5 ）的影响出现在没有过硫化反应的时候，但H2S刺激 eNOS 发生二聚化是由 C443 的过硫化反应所介导的。血管张力(vascular tone)H2S在脉管系统中的主要作用是血管舒张功能（图2），但也有关于H2S双向应答的报道。有关内源性 H2S对血管作用的早期报道来自于 Hideo

10、 Kimura 实验室，其团队在1997年发现数种类型的平滑肌细胞包 括主动脉平滑肌细胞表达 H2S-合成酶并产生H2S，同时观察到H2S鼠中 的平滑肌舒张作用在 NO存在时增强，补充 H2S同样也能增加NO鼠的 血管舒张效应。基于与 NO的交互作用，人们可能预测去除内皮细胞的会 减少H2S介导的舒张作用，但数篇报道显示内皮细胞的去除并不能显著改 变H2S的效应。另外来自Rui Wang的研究显示了 KATP在H2S介导血 管舒张作用中的重要性。有作者认为H2S是一种捉摸不定的内皮源性超极 化因子，基于以下三点：1）它具有超极化内皮细胞和平滑肌细胞膜的能 力；2）对小和/或中KCa电导通道的生

11、物学活性；3）作为血管扩张剂在 有阻力情况下具有更大潜能。图2 H2S的血管生物学活性在不同种类的动脉和鼠结肠肌细胞或鼠心肌细胞中激活 KATP 通道要 求供体 H2S 不同的毫摩尔浓度，而内源性 H2S 的水平几乎都在毫微摩尔 到微摩尔级别。 另外，将 H2S 作用于系膜血管床或孤立的猪脑动脉产生血 管舒张，这一过程仅部分被格列苯脲所抑制。在鼠胸主动脉，高剂量微摩 尔浓度的 H2S 产生血管舒张， KATP 通道阻断剂格列苯脲对其并无影响， 而 Cl?/HCO? 通道抑制剂能减弱血管舒张作用且与血管组织的总代谢抑制 状态有关。数个研究团队报道了毫微摩尔到微摩尔级别浓度的 H2S 可以激 活大

12、 Ca2+ 激活钾电导通道（ BKCa ）和电压门控钾离子通道。一项关于牛 视网膜动脉的研究显示， H2S 供体引发的血管舒张效应对 KATP 的抑制不 敏感，但可被 KV and KIR 的抑制部分阻断。 有关 H2S- 介导的血管舒张通 路及其生理意义仍不明朗，且可能存在重要物种差别。其他H2S相关的通路包括人类微血管中一氧化氮合酶（NOS ）和环氧酶的激活。啮齿动物的血管研究发现内皮 eNOS 敲除后硫化盐的扩张作 用被增强。与NaHS和Na2S增加啮齿动物SMC的cGMP水平一致，Bucci 等研究显示硫化盐诱导的鼠主动脉舒张作用能被 DT-2 （一种 cGMP 依赖 性蛋白激酶 PK

13、G-I 的抑制剂）所抑制， PKG-I 敲除后同样发生舒张作用。 但并非所有 H2S 产生的血管扩张作用均通过 NO/cGMP 通路。例如， H2S 缓慢释放复合物GYY4137对牛睫状动脉的血管舒张作用不能被硝基-I-精氨酸甲酯（ L-NAME ）所阻断，同样的复合物对鼠主动脉的舒张作用不能 被 DT-2 阻断。因此，内源性和外源性 H2S 均能激活多种第二信使，导致SMC的舒张作用。其中所发生的信号通路似乎依赖于所研究的血管床、 物种和所使用的H2S来源。在一定条件下，H2S被发现能增强平滑肌的收缩功能。以鼠的肠系膜动脉床作为研究对象，使用低浓度的H2S （达100凶）促进收缩功能，而高浓

14、度却诱发舒张作用，同样的现象在鼠主动脉和啮齿动物的胃动脉均 被观察到。Li研究大鼠的基底动脉发现，NaHS浓度为1-150側 时的血管收缩作用可被腺苷酸环化酶抑制剂所阻断。以上研究综合在一起，提示 实验室条件和已存条件影响了最终的功能性应答，还需很多额外的研究来 识别哪些情况下 H2S 发挥的是血管收缩功能，而不是常见的血管扩张功与其舒张阻力血管的能力相似， H2S 还对生理状态平均动脉压的维持 有所贡献，通过药物抑制H2S被发现可以升高血压。Yang在内源性H2S 的血管调控方面取得重要进展，其团队发现敲除CSE导致血压呈现年龄依 赖性升高，并丧失内皮依赖性扩张功能。另外，将硫化盐应用于鼠类

15、会导 致一过性血压下降， 使用硫化盐或 H2S 缓慢释放复合物 GYY4137 可降低 高血压基因模型以及通过血管紧张素 -II 或 L-NAME 催化高血压大鼠的血 压水平。血管渗透性( vascular permeability )内皮细胞负责血液和潜在组织之间屏障的形成。不同血管床之间这种屏障功能的严密性差异很大，两个极端的例子就是血脑屏障和有孔的血窦 内皮细胞。血液和间质组织之间溶质的交换发生在毛细血管内。基本的渗 透性对组织的内稳态至关重要， 渗透性过高与数种病理 /病理生理过程包括 组织重塑和修复、炎症、和肿瘤发生有关。最近的研究，Geng 及同事报道吸入 H2S 降低血脑屏障的渗

16、透性，诱导大鼠心搏停止。H2S 的这种作用归因于 VEGF 和基质金属蛋白酶 -9（MMP-9 ）的表达减少，而渗透性 降低生长因子 angiopoietin-1 的表达增加。前期实验显示小鼠中应用 NaHS 能增强吸入悬浮微粒促肺内皮细胞屏障渗透性增加的效应，后期实 验发现，H2S的保护作用由活性氧（ROS ）和Akt所介导。综上，我们可 以得出结论， H2S 限制渗透性，但它的生物学活性是间接的，很可能通过 其抗氧化和抗炎功能发挥作用。 另外， H2S 在缺血再灌注损伤中还具有保 护性作用。 因此， 吸入 H2S 后，肺炎症和随后心搏停止过程中出现的渗透 性下降可能是一种继发性效应，是由于

17、抑制了激活渗透性的那些因子。Yuan 及同事研究 H2S 在体内和体外对血管渗透性的直接作用， 通过 二丙基三硫化物（DATS ）和无机聚硫化物增加渗透性，导致清蛋白流动 增加和透内皮阻力下降。 有趣的是， 这项研究中的 H2S 效应归因于聚硫化 物，而不是H2S，因为产生少量聚硫化物的Na2S和GYY4137与DATS和无机聚硫化物相比只产生微弱的效应。这种增加的渗透性伴随着内皮连 接蛋白 cIaudin-5 和 VE-cadherin 的中断，以及肌动蛋白张力丝形成增强。CSE敲除鼠内皮细胞同样显示了溶质屏障功能增加。将上述实验综合考虑, 现有的数据倾向于认为 H2S 对渗透性的效应为环境

18、依赖性， 需要额外的研 究来剖析生理及病理条件下 H2S 对渗透性的直接和间接作用。H2S 在脉管发生（ Angiogenesis ）中作用体外试验健康的成人内皮细胞（EC）虽然静止不动，但在病理条件或损伤应激 下仍有形成新生血管的能力。被激活后，内皮细胞启动血管生成程序，促 进伤口愈合和组织重塑。在病理条件下如银屑病、关节炎、糖尿病视网膜 病和癌症，也观察到血管生成增加。细胞三联应答，即增殖、迁移、网格 形成，对内皮细胞生成血管非常重要。 有大量前期的体外实验证实了 H2S 能刺激多种EC的增殖、运动和形成管状结构的能力，实验采用的均为外 源性H2S，即硫化盐Na2S和NaHS。体外采用产H

19、2S底物（生成CSE 的半胱氨酸和生成 3MST 的 3-mercatopyruvate ）孵化 EC 能促进脉管生 成，CSE的过度表达强化了 EC增殖并促进血管生长。相反，采用药物或 沉默 CSE/3MST 抑制 H2S 的生物合成，能减少细胞增殖、迁移和细胞管 形成。与上述观察一致， CSE 敲除小鼠的主动脉环在体外血管新生实验中 产生更少的管状结构。 这些实验都说明， 内源性和外源性 H2S 都是促进血 管生成的。体内实验第一个观察外源性 H2S 在体内促进血管生成的实验由 Cai 等完成，其 团队使用 NaHS 增强基质胶植入物的血管生成。 体内对硫化盐的血管生成 应答反应是 eNO

20、S 依赖性的，这一点从实验观察到 eNOS 敲除小鼠的血 管生成减少可以判断。 体内内源性 H2S 对血管生成至关重要， 这一认识来 源于对鸡的绒毛膜尿囊膜(CAM )的研究。用CSE抑制剂炔丙基甘氨酸(PAG)和氰基-L-丙氨酸处理CAM能强化血管侧枝形成和长度。 近来 还发现CSE参与VEGF激活的血管生成过程。与CSE和CBS的血管生成作用一致，补充 3MP (3MST底物)能增 加小鼠的血管生成效应。这些研究提示，不论酶来源于哪( CSE, CBS, 或 3MST)， H2S 都能促进新生血管的形成。这种作用可能是由于气体递质 具有相对长的半衰期，以及能够自由穿梭于膜结构并弥散进细胞室

21、和微环 境中。H2S 介导血管生成的机制H2S 通过环核苷酸、 激酶和离子调控通路促进血管生成。 H2S 供体激 活 Akt、p38 和 ERK1/2 磷酸化， 而 PI-3K/Akt 和 MAPK 的药物抑制剂阻 断EC增殖和迁移。另外，KATP通道幵放剂模仿 H2S应答，KATP通道 阻断剂减弱H2S的血管生成作用。一项人类 EC的实验研究中，KATP通 道开放后激活 p38 上游因子。 H2S 还与 NO/cGMP 通路在多个水平上存 在交互作用。如我们预期，抑制 eNOS 、sGC 或 cGMP 依赖性蛋白激酶 会减弱 H2S 的血管生成作用或使应答变迟钝。VEGF-H2S 的相互作用

22、VEGF 在生理和病理状态下调控新生血管的形成。很多实验已经证实了 H2S 和 VEGF 之间广泛的相互作用。外源性 H2S 上调 VEGF 的表达， 内源性 H2S 对保存 VEGF 应答至关重要。 Saha 及同事发现沉默内皮细胞 的CBS会减少 VEGF信号转导，是由于 VEGF受体2 (VEGFR2)和神经 纤毛蛋白(NRP-1 )的表达减少。CBS来源的H2S能通过Cys68和Cys755 的过硫化反应稳定 VEGFR2 转录所需的特异蛋白 1(Sp1 )。除此之外， H2S还参与了 VEGF信号转导。将人类EC短期暴露于VEGF会增加H2S 的产生。产生的H2S激活下游因子，因为

23、CSE抑制阻断了需VEGF刺激 的p38和ERK1/2的活化。因此VEGF激活EC的血管生成效应可被药物 抑制或基因沉默 CSE/CBS 所强化。最后，有研究发现 H2S 会加强 VEGF 与 VEGFR2 结合后的激活作用， VEGFR2 的 Cys1045 和 Cys1024 之间存 在双硫键，它抑制受体酪氨酸激酶的活性。 H2S 对双硫键的亲核攻击导 致双硫键裂解，并增强 VEGFR2 受体酪氨酸激酶活性。在损伤或疾病情况下的脉管生成H2S 在组织缺血、 心力衰竭、 伤口愈合和癌症的病理状态下也具有促血管生成的作用。两项独立研究分别使用硫化盐和 DATS ，结果显示 H2S 能增加血管生

24、成和恢复缺血组织的功能。 H2S 对后肢缺血有益处， 它通过 eNOS 依赖的和独立的机制增强 NO 的产生， 并增加缺氧诱导因子 （ HIF1 a）的表达和活性。在心肌缺血模型中，H2S前体S-炔丙基半胱氨酸促进血管生成并改善组织灌注。在脑动脉闭塞的大鼠模型中，在梗死区周围， 采用硫化盐增加内皮增殖和血管生成，改善功能性预后。在股动脉结扎模 型中，动脉生成过程被 CSE缺乏（CSE敲除小鼠）所抑制，成熟的血管密 度、血管生成指数和血流显著减少。血管形成增加是癌症的标志之一。有数个研究发现癌症增加产 H2S 酶的表达。采用生长于 CAMS的透明细胞肾细胞癌（ccRCC）异种移植物 研究模型，抑

25、制 CSE 减少了 ccRCC 的血管化。另外， CBS/CSE 抑制剂 AOAA能减少结肠癌和卵巢癌细胞异种移植物模型中CB31-阳性的血管结构，即 CBS 沉默后在肿瘤中诱导的血管生成减少。 肿瘤中的血管生成很 可能是由于肿瘤来源和宿主来源 H2S 的产生所诱导，但各自潜在 H2S 源 头的贡献还有待进一步研究。血管壁中 H2S 的抗氧化剂和抗炎症效应高血压、 粥样硬化和糖尿病血管并发症中， 血管壁上的氧化应激增强。H2S 抑制 ROS 产生，但也通过直接的方式、 上调 GSH 和增加抗氧化剂酶的表达来消除ROS。将NaHS应用于血管紧张素II促成的高血压小鼠， 能减少主动脉 NADPH

26、依赖性过氧化物的产生，并改善 ACh 诱导的舒张 作用。同样， H2S 减少高糖培养的内皮细胞中的 ROS 水平，预防细胞凋 亡和内皮细胞损伤。腺病毒介导的CSE基因转移或使用硫化盐，在高糖环 境下能减少ROS产生并改善内皮依赖性血管舒张，而CSE敲除导致更大程度内皮功能的损伤。 采用 NaHS 预处理高糖环境中的细胞， 能减少细胞 内活性氧水平，抑制 NF-启活性，抑制细胞内粘附分子-1 (ICAM-1 )的 表达。H2S 在粥样硬化环境中的抗氧化剂效应也被发现， 它导致疾病进展延 迟、减轻严重程度。 在血管炎症和粥样硬化中单核细胞的募集和聚集是 关键一步，它依赖于细胞黏附分子ICAM-1、

27、VCAM-1和P-选择素的表达。 H2S 诱导对内皮细胞 ICAM-1 表达的抑制。 H2S 还被发现能减少炎 症细胞因子水平，包括单核细胞 /巨噬细胞的IL-1 B、TNF- a和IL-6。H2S 还能协调增生和收缩蛋白的表达， 使之分化为不同的平滑肌细胞 表型。CSE敲除动脉中的平滑肌细胞在体内和体外实验中均展示出增殖能 力增加，而H2S供体或CSE过度表达却抑制血管 SMC生长和促进培养 基中 SMC 的凋亡。 H2S 也减少 SMC 迁移， H2S 产生减少时导致新生内 膜增加。 上述 H2S 对 SMC 行为的效应最终表现为抗粥样硬化作用和抑制 损伤状态下的异常血管重塑。在疾病中血管

28、网内的 H2S 水平和信号转导的改变在心血管疾病中，缺乏 H2S 导致至少一些血管功能异常。高血压时 H2S相关通路调控异常。自发高血压大鼠中的CSE水平减低，地塞米松诱导的高血压大鼠中阻力血管的 CSE和CBS表达减少。CSE敲除小鼠可 发生高血压，说明低CSE水平和高血压之间有因果联系。人类高血压患者的队列研究中发现 H2S 血浆水平下降。在高血压动物模型中，应用 H2S 可以降低平均动脉压并逆转与高血压相关的血管重塑。给 CSE 敲除小鼠喂食高脂饮食导致脂纹形成、 氧化应激增加、 粘附分 子的表达和内膜增生。 粥样硬化的发生可被外源性 H2S 所逆转。 在 ApoE 敲除动物模型中，抑制

29、 CSE会增加趋化因子/趋化因子受体CX3CR1和 CX3CL1 ，并加速粥样硬化进程。更有甚者， CSE/ApoE 双敲除动脉模型 会展示出更广泛的粥样硬化病变， 但是其表型可被外源性给予 NaHS 所挽 救。斑块内的新生血管使斑块脆性增加， 而 H2S 是已被证实的促血管生成 的刺激因子。最近 van den Born 的研究发现人类粥样斑块新生血管中 CSE表达增加。因此，虽然 CES/H2S预防病灶形成，但是在已存在的粥 样斑块中它很可能会刺激斑块破裂。粥样硬化动物模型和细胞干预研究提供了 H2S 具有保护效应的潜在 机制。研究发现，基因改造ApoE敲除小鼠使CSE过度表达，改善了脂质

30、 尺寸，下调NF- K的激活，减少病灶形成， 进一步证实了 CSE/H2S通路 是潜在的抗粥样硬化的治疗靶点。在 Liu 和同事的研究中，对 ApoE 敲除 鼠使用 H2S 供体 GYY4137 能减少斑块大小以及促炎症细胞因子形成及过 氧化物水平。因此， H2S 似乎在血管壁中激活抗氧化通路，保留或增加 NO 的活性，减少促炎症细胞因子的产生和降低其活性。慢性血液透析患者中，粥样硬化发展迅速者相比于相对健康的血透患 者有更低的血浆 H2S 水平，在糖尿病肾病透析患者中，血浆 H2S 水平与 粥样硬化和炎症标志物 MMP-12 水平呈负相关。 健康的群体中， 血浆 H2S 水平与脂联素和高密度脂蛋白（HDL ）呈正相关，与粥样硬化风险标志物 LDL 呈负相关。与粥样硬化的研究相似，糖尿病患者合并或不合并高脂血症，通常都 与低水平的血浆 H2S 有关。糖尿病动物模型中， 也同样发现血浆或组织中 H2S 水平下降。但是也有关于糖尿病时 H2S 水平升高的报道。例如，链 脲霉素诱导的糖尿病大鼠， 在其肝脏和胰腺中发现 H2S 水平升高。 另一项 研究发现胰岛素治疗后 CBS和CSE表达下降，提