生物工程生物技术专业英语翻译(六)

1、第六章 生物工程中的下游加工技术6.1前言“下游加工技术对于从任何工业化生产中回收有用产品所需要的所有步骤来说是一个有用的词语。对于生 工程特别重要，我们想要的最终形式的产物常常非常远的从 最先在生物反响器中获得的状态除去。例如，一个典型的发 酵过程是一个分散的固体细胞、也许有营养培养基的某些 组分等与稀释水溶液的混合物；所想要的产物也许作为一 种非常复杂的混合物的组分存在于细胞中，或者存在于稀释 的培养基溶液中，或甚至两者中都有。任何情况下，这个产 品的回收、浓缩和纯化都需要有用并有效的操作，这也受生_产经济性的限制。任何特殊的要求，如需要除去污染物或限 制生产微生物process orga

2、nism 都只会增加困难。许多实验室中的标准操作在生产中都是不实用或者不经济的。而且，生物产品常常是非常脆弱labile 敏感的化 垂悬分词 合物，其活性结构只能在限定并有限的pH、温度、离子强度 等条件下才能保持。想着这些限制bearing in mind 女口果要用到所有可用的科学方法以发挥最正确的效果就需要更 多的创造性。也明显的是，没有一种独特的、理想的、普遍 适用的操作或者仅是操作顺序可以推荐；对一个特定的问题 应当以最适宜的方式把单个单元操作结合起来。6.2粒子的别离在发酵终点，多数情况下第一步是将固体(通常是细胞， 但也可以是在一个特定支持物上的细胞或者酶，不包括反响 培养基固体

3、组分)从几乎一直是水溶液的连续均匀的液体系 统中别离出来。与这个别离相关的一些细胞特性列于表6.1 ；注意，细胞的比重不比fermentation broth 大很多。细胞的大小也给细菌带来了困难，但是比拟大的细胞更容易分 离，有时候甚至只需要简单的定位于倾析器。别离的容易性 取决于fermentation broth 的性质，它的 pH、温度等等， 在许多情况下，通过添加助滤剂、絮凝剂的等等进行改良(见 后面)。表6.2给出了别离方法的大体分类。6.2.1 过滤这个是别离 filamentous fungi 和 fermentation broth 中的 filamentous bacter

4、ia(例如，链霉菌)所使用的最广泛和最典型的方法。它也可以用于酵母絮凝物的别离。根据 机理，过滤可以采用外表过滤或者深层过滤；或者离心过滤；所有情况下的驱动力都是压力，由超压产生或者由真空产 生。过滤的速率，如在一定时间收集的滤液的体积，是过滤 面积、液体的黏度和通过过滤基质的压力降以及(depositedfilter cake )沉积的滤饼的作用。过滤基质与滤饼filtercake的抗性(resistance)因此是关键的，决定了它的可压性(compressibility )。 对于不可压的 filter cake 滤饼， 过滤速率与压力无关，但是多数生物材料是可压的，所以滤 饼的抗性随着时

5、间而增大而与过滤和滤饼形成过程中增大 的总体抗性无关。错流过滤实现了过滤流的巨大的改良，在错流过滤中， 固体不经过过滤器而通过跨膜的湍流保持悬浮状态。这可以 通过安排悬浮物流经膜来实现或者通过在过滤器中固定移 动的 blades or impellor来实现。简单的平板过滤广泛用于液体的澄清，也可以用于过滤少量的悬浮物，但是它们的 载量是有限的；有时使用filer-press assemblies 尤其对于分批操作。旋转鼓式真空过滤器大概是从fermentation broth 分离微生物最为广泛使用的装置；在这些过滤器中，过滤局部 是一个旋转的鼓维持在减少的压下。这个鼓转到液体中进行 过滤，

6、它的连续转动使滤饼层进行重要的后续操作，如图6.1所示。为了防止在过滤器外表形成生物体增加过滤的抗性， 这种过滤器常常 fitted with a knife discharge，像图中所描绘的; if a mycelium which forms a coherent carpetis being seperated, it can be lifted from the filterby strings.常预先用助滤剂覆盖(precoate ) 鼓，有助于防止阻塞并且保持一个恒定的压力降。最主要的优点是以最 小的升温、低的动力消耗及将过滤与洗涤和局部去水(dewatering )相结合而有效

7、过滤：但是助滤剂被过滤掉的物质所污染是一个严重的缺点。也可以使用在正压下操作的 旋转过滤器。而带式过滤器belt filter 是对原理明显的改动，非常适于需要大量洗涤的易过滤的沉淀物。带式滤器可以与 a press 结合以促进除水。622 离心细菌往往由于太小而不能由简单的过滤基质进行别离， 但通过离心进行别离也是困难的因为粒子与悬浮液之间密 度的微小差异。经常采用离心别离蛋白质沉淀也有类似的困 难。离心机的效果可以特征表达为:方程式在表达式中，0体积进料速率、d=粒子直径、 p =密度差、 g=重力加速度、F=沉淀面积、n =黏度、R=radius、3二角速 度及门=每分钟的转速。公式刀=

8、FZ在比拟不同的离心机的时候是有用的。因为F随着转子旋转axial 长度的增加而增加，而 Z随着转子 的直径和速度增加而增加，通过采用长转子F或者快的、宽转子Z可以改良别离效果；可获得的Z值受到结构材料的限制。图6.2列出了一些转子的安排方式，不同安排方式的关键特点总结在表 6.3中。所有的设计都有单独的缺点， 添加上本钱包括维护、动力消耗及温度升高除过结合 冷冻这些总体缺点。絮凝和浮选既然细菌的微小细胞大小使从fermentation broth 中 对它们进行回收变得非常困难，甚至通过离心的方法，那么可以采用絮凝实现一种改良；粒子的沉淀速率随着粒子直径 的增大而增大 Stokes '

9、; s法贝U。絮凝可以是可逆的，女口 果细胞外表的电荷能够被相反电荷的离子中和，也可以是不 可逆的，如果带电的多聚分子在细胞之间形成桥。因此絮凝 剂就包括无机盐、矿物水胶体、有机polyelectrolytes. 除了取决于絮凝剂的选择，絮凝作用还取决于这样的其他一些 因素如细胞的性质生理年龄、离子环境、温度及外表shear stress。如果没有形成一个足够紧密的絮凝物，那么可以采用浮 选的方法，在这个过程中小的气泡吸收并进入到微生物中。 这种别离取决于气泡的大小；气体可以鼓泡产生或者更好 的非常精致的气泡可以由溶解的气体释放过多的压力来产 生或者通过电解作用。不可溶的“收集物质如长链脂肪酸

10、或者胺可以促使一个稳定的肥皂泡的形成，而且收集在肥 皂泡层的粒子能被除去。在某些情况下，絮凝和浮选的联合 使用非常有效地用于回收生物体。6.3细胞破碎6.3.1 微生物由于细胞壁的强度和高的在渗透压，破碎微生物常常是 困难的；粒子太小而不能采用简单的机械手段如碾碎而获彳 必要的强力。同时，细胞破碎不能破坏所需要的细胞组分， 但通常所作的要矛盾的。分解微生物的方法总结于 图6.3中。 它们的作用效果通常以破碎的细胞的悬浮液中回收的细胞 酶的活性水平来证实assessed ，与以破坏程度衡量破坏 效率相结合。机械方法机械方法采用的是shear 在球磨机、胶磨机中搅碎、 压力和释放压力匀浆机及超声波

11、。一种广泛使用的方法 是采用高压紧接着突然的解压，是由细胞悬浮液流经finenozzle管口的结果。其中的一种处理方法如 图6.4所示。这 里，破碎是由 hydrodynamic shear 和空穴现象导致的。超 声波主要通过空穴现象而作用，但主要用于实验室，因为在 大规模中，热量的除去是困难的。也可以采用加热、化学或者酶方法来破坏细胞。其中一种广 泛使用的方法就是枯燥，它引起细胞壁结构的变化而且常常 可以用缓冲液或者盐溶液对细胞物质进行后续提取；一个著 名的程序就是将细胞导入过量的冷丙酮中以制备“丙酮粉。通过化学方法可以引起细胞裂解，如盐或者外表活性剂、或 者渗透压冲击、或者采用适宜的裂解酶

12、，现在可利用的裂解 酶的种类非常多而且可以与所要处理的微生物的具体性质 相匹配。采用所有的方法并进行比拟，细胞破碎后活性细胞 酶的回收效果经酶处理和超声波处理为最好；加热或者渗透 方法次之，而机械法破碎通常效果最差。632植物和动物细胞来自动物组织或者植物的细胞通常不稳定且更容易通过机械方法破碎。如果物质首先经过冷冻，就可采用额外白shea方法，而适宜的酶就可以帮助从动物或者植物中进行 提取。在技术上，人们非常关注通过适宜的裂解酶纤维素 和半纤维素处理来提高所有植物提取量而不是传统的提取 方法。6.4提取方法当用于生物产品时，提取同时具有别离和浓缩的作用。对于回收亲脂性物质尤为有用，不管这些物

13、质最初是胞外的 还是通过对细胞的适宜处理而释放出来的。含有目标物的溶 液或者甚至是悬浮液与不相溶的溶剂相混合，产物在这个溶剂中是更易溶解的而且更容易进行特异回收。物质在这两 相中的分配由它的特征分配系数K控制：K=A相中物质的浓度/B相中物质的浓度然而，任何实际的提取过程的系数还取决于达平衡时两相的to be.积。由简单的计算可知，当以一定体积的溶剂萃取某 一物质时，如果将溶剂分成假设干等分，分数次相继进行，那么 萃取的效率较高；而当欲差异地萃取某一种组分，而非其他 组分时，那么反萃取必能提高选择性。这样，液-液萃取可以 单步进行如果分配系数是非常理想的，通过多步顺流萃取或者逆流萃取最复杂的处

14、理过程但是能够很好的处理混合物。在回收抗生素时，溶剂萃取是在除去细胞或者细胞碎片 后的早期步骤。全发酵液的萃取也可采用萃取-倾析器，萃 取柱或者用到离心机的混合澄清器。图6.5例如了一个从发酵液中回收抗生素的全发酵液提取过程。全发酵液回收方法明显的减少了回收步骤，这样应该会减少步步损失尽管萃取过程由于细胞的存在会被削弱 impaired。减少了产物滞留于水溶液相中的时间，在水相中 产物的降解是非常快的，这也是一个优点。从细胞或者细胞碎片中别离酶可以采用水溶液多相系统进行萃取。细胞碎片和酶分配在水溶液的聚乙二醇-葡聚 糖混合物中，其形成别离相且因此可以容易的别离开。这个 方法防止了在离心过程中出

15、现的一些困难小粒子尺寸 dimension 而且产量高。6.5浓缩方法生物加工过程中形成的低浓度产物通过初始别离步骤而被浓缩，如在萃取过程见上，但一般在经济纯化之前必须进一步浓缩。又由于许多产物的脆弱性，对它们浓缩的 方法必须非常温和。一些适宜的方法包括：萃取已经考虑到了蒸发膜处理过程due to.离子交换法吸收法蒸发蒸发常用于溶剂提取所得到的溶液，在这种情况下，小 心的处理以回收蒸发的溶剂是必要的；因为蒸发产生高的特 殊的热量，当用于水溶液制备物时，需要更为关键的处理。 全发酵液的直接蒸发常用于制备相对低级的产物，通常采用非常普遍的是，采用短滞留时间的蒸发器以减少由于热 不稳定性而引起的损失

16、。连续流动蒸发器可以对快速通过的 物质中不稳定的产物进行浓缩；在降膜falling film 蒸发器中，热交换器更好，基于大的热交换外表，它使得在加热 介质与溶液之间产生最小的温度差。滞留时间are in theorder of a minute. In thin-film evaporators,薄层是通过机械方法形成的且非常湍流的；热交换器是非常有效 的，而且这些蒸发器可以用于浓缩黏性液体，甚至浓缩至干燥的产品。在离心式薄膜蒸发器 thin-film evaporators 中， 蒸发是在旋转转筒中的加热圆锥_conical壁上进行的，滞留时间甚至更短。6.5.2 膜过滤膜过滤是一种多功能

17、的程序，可以用于富集和别离不同如果采用的压力超过溶液的渗透压，那么粒子就可以通过某 种适宜的膜，渗透压驱动浓溶液中的溶剂流向更稀的溶液。 在超滤中，膜可以看作一个筛网microporous 膜 它的孔的大小控制着别离，但是这种简单的模型不能用于反渗 透，在反渗透过程中，相似大小的分子仍然是别离的。这依 赖于分散及分子与膜材料之间的相互作用。图6.4给出了应用膜过滤过程的例子。为了获得高的流速，通常采用不对称膜，它具有由一种 coarser海绵状结构机械支持的紧密的薄膜层。超滤过程中 出现的最严重的问题之一是“浓差极化现象。在膜高浓度 的一面，溶液的浓度随着靠近膜而增加，而在膜的另一面为 零。这

18、导致形成“次级膜作用，具有不同的flux和别离特性。与在错流过滤中一样，尽管不能完全用经过膜外表高 的流速来消除这种作用，但是可以减少，采用高的泵速包括 湍流或者对高速层流装配thin channels。典型的装置如图6.6 和图 6.7。微滤可以取代过滤以从发酵液中别离细胞或者甚至是 特定的代产物：封闭的系统便于无菌操作，而在必要的时候 也便于进行限制。离子交换和吸附树脂使用吸附剂从发酵液中回收产物是一种长期所采用大 方法，最初基于活性炭的使用。这种方法经过单一的步骤就会产生非常大的浓缩效应，而且由于可以采用大围的较特异 的吸附剂，所以被越来越多的采用。例如，在研究 新的抗生素回收方法中，e

19、xploration探测常常是初始步骤之一。离子交换树脂离子交换树脂是带有紧密连接的可离子化基团的多聚物，离子基团根据选择可以是阳离子或者是阴离子，而且根 据环境条件可以是离子形式或者为非离子形式。可采用的类型列于表6.5中；固体离子交换剂可以采用分配 参加，然后通过倾析除去，或者采用柱程序使用。涉及这种 离子交换柱的色谱别离将在下面的局部中讨论。液体离子交换剂通过相似的原理进行操作，但是可离子 化的物质之溶液非水溶剂载体中；然后通过液-液萃取进行 别离。不管是哪种情况，目标物质通过离子解离从离子交换 剂上回收，然后对离子交换剂进行再生。在适宜的情况下，抗生素可以从全发酵液中进行回收， 在分批

20、式发酵中相对于澄清发酵液而选择采用离子交换树 脂。吸附树脂这些树脂提供了与不能混合的液体溶剂有相似特性的固体相，因此可以用于萃取过程。现在，有大围这样的树脂 可以使用，将它们重要的特性总结在表6.6中。该树脂是孔状的多聚物载体，其功能基团，如果是任易的一种，修饰载 体的总体极性，不离子化。多数化合物处于耳通常从水溶液中被吸附；通过有机溶剂萃取或者改变溶液相的 pH或离子强度而对它们进行回收。吸附树脂的孔隙度是重要的，因为孔隙度决定了可进行吸附的外表积，从而决定了树 脂的吸附容量。6.6混合物的纯化和分解在设计的适宜的过程顺序中，产物的回收和浓缩已经伴 有某些程度的纯化。然而，进一步纯化产物的需

21、求通常存在， 尤其是当目标产品伴随有重要的相似的副代物的时候，这些 副代物常常可以通过早期的回收步骤。因此，在纯化时将要 面对的清况也许需要高度的分解或者也许不需要。两种常被 使用的方法是结晶和各种色谱操作；结晶更容易进行放大， 但是色谱方法有助于混合物更好的分解。6.6.1 结晶结晶主要用于纯化低分子量化合物，如抗生素。例如，常采用丁酸乙酯butyl acetate从发酵液中提取青霉素 G,并通过添加乙醇溶液中的乙酸钾potassium acetate 进行结晶。图6.8是采用相似的顺序别离和纯化放线菌素的过程。 结晶开始于 50 C下在乙酸乙酯 ethyl acetate 中浓缩某一溶 液

22、，通过向溶液中添加轻汽油直到溶液变得浑浊，;将溶液 加热到65 C然后冷却 在一个更大的规模中，结晶是纯化柠檬酸和次谷氨酸盐 这种产品的最后步骤。662 色谱方法色谱方法用于低分子量的化合物如同源抗生素，需要重溶混合物 resolution ，及巨大分子尤其是酶，产物有着及其相似的性质。必要的设备是柱子，填充有载体材料，通 常是粒子，储藏和泵系统for洗脱液，有选择的收集洗脱组分。根据具体的别离问题，柱子的比例可以变动，从相对高的窄的柱子到短的宽的柱子； 一个例子是Pharmacia segment column，这个柱子是由不锈钢构建的。为了获得最大处理量，采用大小均匀的微粒；柱的填充常常受

23、到在别离的罐中混合 吸附剂与溶剂系统的影响，如果需要在减少的压力下除气， 然后以稠的糊状物传递到柱子中。某些物质尤其是在分子筛 层析中使用的那些物质，当用缓冲液与有机溶剂平衡或者用 不同离子强度的缓冲液平衡 盐梯度洗脱的时候，体积 发生变化，然后必须固定到柱子中采用可调节的end-plate。柱子可以进行向上和向下流动操作，通常安装有泵输入的液 体的流动计和一个输入压力控制装置。在柱子的两端安装无 菌滤纸是所需要的，以消除细菌的污染和可能的产物破坏。通常情况下需要控制每一阶段从柱子上被洗脱下来的 组分，如遵照洗脱液在 254nm和280nm处的紫外吸收分别是 核酸和蛋白质；缓冲液梯度通过衡量电

24、导性来控制，或者在 极端情况下，安装自动分析仪旁路途径来控制。为了分开已 别离的产物需要某些形式的局部收集器，而且对于使用有机 溶齐的大 规模分 离过程，this must be a flame-proof installation in an explosion-proof room.不同的层析过程可以按以下区分为：吸附离子交换凝胶过滤疏水亲和共价分配这些层析的特性描述如下。吸附层析 别离产物依据的是它们对固体介质外表不同的吸 附性，可以是无机载体如硅胶、氧化铝或者羟基磷灰石，也 可以是有机多聚物。离子交换层析使用的这类树脂已经讲述过了，或者使用不 可溶或交联的多糖纤维素，琼脂糖，离子功能基

25、团吸附到上面。它对巨型分子的分解高;图6.9给出了分解复杂的蛋白质混合物的例子。这个所示的是生产规模的人血浆蛋白 的别离，通过联合离子交换层析第4, 6步与凝胶过滤第2,9步。凝胶过滤 利用“分子筛效应的，即一种中性的交联载体 其有确定的孔大小以进行分子的别离。大于最大孔的分子不 能进入到介质部而直接通过柱子；小一些的分子进入载体部 并被保存；这样分散到孔中是由于孔大小的作用，所以保存 的分子就可以按照分子大小减小的顺序洗脱下来。与分子量围从几百到百万或者更大相对应，就需要大围 的可控孔大小的载体；它们通常由线性多聚物产生葡聚糖、 琼脂糖，受交联度的控制。这些一般在溶液系统中使用， 凝胶过滤液

26、可以用于多肽或者蛋白质溶液的除盐。引入相对 疏水基团的分子筛可以在有机溶剂中使用，以相同的方式分 离亲脂性物质。疏水载体 具有不同疏水性的分子可以在含有疏水基团的 载体上得到别离。因此，许多酶和其他蛋白质具有疏水区域， 该区域积累中性氨基酸如缬氨酸、苯丙氨酸，将与连接有不同长度酰基的载体发生不同程度的相互作用。亲和层析 利用更专一的相互作用进行别离；在固体支持物 载体上连接上一种特定的结构，并且与欲别离的化合物发生 特异的相互作用。别离原理如 图6.10所示。特异性效应物 如酶的抑制剂I 固定在不溶于水的载体上 C，载体被 填充到一个柱子中。弓I入含有不同酶Ei、巳、民、巳.的复杂混合物的中性

27、缓冲液，当Ei被抑制剂I复杂化，所有剩下的酶通过柱子。采用不同pH的缓冲液，现在，酶 Ei就可以选择性的从柱子上洗脱下来。可以别离的典型的特异性效应物与互补分子包括：酶/酶的抑制剂(或反之亦然)抗体/抗原或者半抗原( or vice versa )外源凝集素/糖蛋白或多糖核酸/互补碱基序列激素/受体维生素/载体蛋白这种类型的别离依赖于相同的高特异性相互作用，这种 作用调控着生物过程。例如，脱氢酶根据它们与辅酶的特异 性作用采用带有键合的 NAD的琼脂糖载体可以进行别离。可 以利用抗原/抗体反响：例如经过带有固定的单克隆抗体的 琼脂糖层析，人白细胞介素以高产量且高纯度形式得到回 收。显而易见，这种固定的特异性效应物的本钱是非常高的， 应该屡次循环使用。为了制备特异性固定物，载体如琼脂糖凝胶in headform要被活化，例如通过与溴化氢反响， 然后当连接的是小 分子的时候如辅酶，就可以直接进行连接，或者当要连接的 是较大的效应物分子的时候通过“手臂分子进行连接。基团-特异性亲和层析以相似的方式采用低特异性的“化学相互作用；例如，带有二羟硼基的多聚物可以别离糖蛋 白和核苷酸因为在硼酸和1,2 diols 之间可以形成可逆的复合物。共价层析 是一种微小的变化，利用固定的功能基团与欲纯 化的物质之间形成可逆的共价键；特别是，硫醇化的多聚物 可以用来别离含有 SH-的蛋