分子生物学3.7

1、本章主要内容：本章主要内容：3.1 RNA的结构、分类和功能的结构、分类和功能3.2 RNA转录的基本过程转录的基本过程3.3 转录机器的主要成分转录机器的主要成分RNA聚合酶聚合酶3.4 启动子与转录起始启动子与转录起始3.5 原核生物与真核生物转录产物比较原核生物与真核生物转录产物比较3.6 原核生物与真核生物原核生物与真核生物mRNA的的特征比较特征比较3.7 真核生物真核生物RNA的转录后加工的转录后加工3.8 RNA的编辑、再编码和化学修饰的编辑、再编码和化学修饰本节主要内容本节主要内容3.7.1 真核生物真核生物RNA中的内含子中的内含子3.7.2 真核生物真核生物tRNA前体的转

2、录后加工前体的转录后加工3.7.3 真核生物真核生物rRNA前体的转录后加工前体的转录后加工3.7.4 真核生物真核生物mRNA的剪接的剪接3.7.1 RNA中的内含子中的内含子非编码区非编码区编码区编码区真核基因真核基因大多是大多是断裂断裂的的:一个基因可由一个基因可由多个内含子多个内含子和和外显子外显子间隔间隔排列而成。排列而成。内含子在真核基因中所占的比例很高，内含子在真核基因中所占的比例很高，甚至超过甚至超过99%。 Exons (外显子外显子): the coding sequencesIntrons (内含子内含子) : the intervening sequences3.7.2

3、 真核生物真核生物tRNA前体的转录后前体的转录后加工加工 真核生物真核生物tRNA基因有内含子，其前体必须基因有内含子，其前体必须以过剪接。以过剪接。3.7.2 真核生物真核生物tRNA前体的转录后前体的转录后加工加工 真核生物真核生物tRNA基因有内含子，其前体必须基因有内含子，其前体必须以过剪接。以过剪接。tRNA内含子的特点内含子的特点 （1）长度和序列没有共同性，一般有）长度和序列没有共同性，一般有1646个核苷酸；个核苷酸； （2）位于反密码子的下游。）位于反密码子的下游。 （3）内含子和外显子的边界没有保守序列，）内含子和外显子的边界没有保守序列，所以其前体的剪接不符合一般规律。

4、所以其前体的剪接不符合一般规律。真核生物真核生物tRNA转录后加工转录后加工 真核生物真核生物tRNA前体内含子的精确切除信号前体内含子的精确切除信号是是tRNA分子共同的二级结构。分子共同的二级结构。真核生物真核生物tRNA转录后加工转录后加工(1)内含子的剪接内含子的剪接tRNA核酸内切酶核酸内切酶切割前体分子中的内含子，切割前体分子中的内含子，RNA连接酶连接酶将外显子部分连接在一起将外显子部分连接在一起真核生物真核生物tRNA转录后加工转录后加工(1)内含子的剪接内含子的剪接（2）3端添加端添加CCA在在tRNA核苷酸转移酶核苷酸转移酶的催化下在其的催化下在其3端端添加添加CCA。真核

5、生物真核生物tRNA转录后加工转录后加工(1)内含子的剪接内含子的剪接（2）3端添加端添加CCA（3）核苷酸修饰）核苷酸修饰 3.7.3 真核生物真核生物rRNA前体的转录后加工前体的转录后加工新生新生rRNA前体与蛋白质结合，形成巨大的核糖核前体与蛋白质结合，形成巨大的核糖核蛋白前体颗粒，因此，蛋白前体颗粒，因此，rRNA前体必须被剪切成成前体必须被剪切成成熟的熟的rRNA分子，此过程在核仁中进行。核仁小分分子，此过程在核仁中进行。核仁小分子子RNA(snoRNA)参与核糖核酸酶对特定立体结构参与核糖核酸酶对特定立体结构的识别，从而确定切割位点。的识别，从而确定切割位点。 3.7.3 真核生

6、物真核生物rRNA前体的转录后加工前体的转录后加工（1）在）在5端切除非编码的序列，生成端切除非编码的序列，生成41S中间产物中间产物。（2）41SrRNA再被切割为两段，一段为再被切割为两段，一段为32S，含，含有有28SrRNA和和5.8SrRNA，另一段为，另一段为20S，含有，含有18SrRNA.(3)32SRNA进一步被剪切成进一步被剪切成28SrRNA和和5.8SrRNA。（4）20SRNA被剪切生成被剪切生成18SrRNA. 3.7.4 mRNA的剪接的剪接 (Splicing)RNA splicing: removal of introns and joining of exo

7、ns. It takes place in the nucleus before the mature mRNA can be exported to the cytoplasm. Catalyzed by spliceosome (RNA +protein)5加加“帽帽”和和3酶切加多聚腺苷酸酶切加多聚腺苷酸mRNA的前体的前体(核不均一核不均一RNA, hnRNA)RNA的剪接的剪接连续的可译框连续的可译框(ORF)(open reading frame）蛋白质合成的模板蛋白质合成的模板通过核孔进入细胞质通过核孔进入细胞质P94/101表表3-10P95/101图图3-23真核基因真核基因

8、平均含有平均含有8-10个内含子个内含子，前体分，前体分子一般比成熟子一般比成熟mRNA大大4-10倍。倍。不同生物细胞内含子的边界存在相似的核不同生物细胞内含子的边界存在相似的核苷酸序列苷酸序列,表明表明内含子剪接过程在进化上是内含子剪接过程在进化上是保守的。保守的。P93/102P93/102P93/102P93/102比较同源基因的进化过程发现内含子的异比较同源基因的进化过程发现内含子的异化大于外显子化大于外显子,特定的内含子还可能在进化特定的内含子还可能在进化过程中丢失过程中丢失,因此因此,内含子的内含子的“功能功能”及其在及其在生物进化中的地位是一个引人注目的问题。生物进化中的地位是

9、一个引人注目的问题。P93/102P93/102 例如：例如： 地中海贫血病人的珠蛋白基因中，大约有地中海贫血病人的珠蛋白基因中，大约有1/4的核苷酸突变发生在内含子的的核苷酸突变发生在内含子的5或或3边边界保守序列上，或者直接干扰了前体界保守序列上，或者直接干扰了前体mRNA的正常剪接。的正常剪接。内含子剪接异常引起疾病内含子剪接异常引起疾病P93/102P93/102P98/106P98/106表表3-113-11 断裂基因发现不久，断裂基因发现不久，Crick（1978年）年）就提出了一系列发人深思的问题：就提出了一系列发人深思的问题：（1）剪切作用若是通过酶来进行的，那么这）剪切作用若

10、是通过酶来进行的，那么这种剪接酶是怎样识别种剪接酶是怎样识别RNA上特定的位点？上特定的位点？（2）剪切酶有没有特异性？对不同的）剪切酶有没有特异性？对不同的RNA是是否需要不同的酶？否需要不同的酶？（3）切除的）切除的RNA是以线状还是环状存在的？是以线状还是环状存在的？切下的切下的RNA的命运将如何？的命运将如何？ Chambon等分析比较了大量结构基因的内含等分析比较了大量结构基因的内含子切割位点，发现有子切割位点，发现有2个特点：个特点：（1）内含子的两个末端并不存在同源或互补。）内含子的两个末端并不存在同源或互补。（2）连接点具有很短的保守序列）连接点具有很短的保守序列,亦称亦称边界

11、序列边界序列。 100种内含子的种内含子的5端都是端都是GU；3端都是端都是AG，因此称为因此称为GU-AG法则（法则（GU-AG rule），又称，又称为为Chambon法则法则。P95/102P95/102 GU-AG法则（法则（GU-AG rule）不适用不适用于线粒体、叶绿体的内含子，也不适于线粒体、叶绿体的内含子，也不适用于酵母的用于酵母的tRNA基因基因 。 脊椎动物前体脊椎动物前体mRNA中常见内含中常见内含子剪接所必需的保守序列子剪接所必需的保守序列A 两个剪接位点的序列是不同的：两个剪接位点的序列是不同的： 左边的剪接位点称左边的剪接位点称供体供体(donor)位点位点， 右

12、边的剪接位点称右边的剪接位点称受体受体(acceptor)位点位点。除了边界序列之外，外显子与内含子除了边界序列之外，外显子与内含子交界处的序列，内含子内部的部分序交界处的序列，内含子内部的部分序列都有可能参与内含子的剪接。列都有可能参与内含子的剪接。核核mRNA结构特点结构特点1. 边界序列边界序列:其边界序列是完全符合其边界序列是完全符合GU-AG法则法则2. 分枝点序列分枝点序列：具有分枝点序列，位于内含子：具有分枝点序列，位于内含子3端上游端上游18-50nt处，序列为处，序列为Py80NPy87Pu75APy95，其中其中A为百分为百分之百的保守，且具有之百的保守，且具有2-OH。3

13、. 内含子内含子5端有一保守序列端有一保守序列(5GUAAGUA3)可以和可以和U1 snRNA的的5端的保守序列端的保守序列3CAUUUCAU5互补。互补。P95/102P95/102核核mRNA的剪接的剪接 转录产生的核内转录产生的核内mRNA前体分子与蛋白前体分子与蛋白质结合，形成质结合，形成RNA和蛋白质组成的和蛋白质组成的snRNP复合物（复合物（ribonucleo-protein protein）。）。 随着随着RNA链的延伸，每个内含子链的延伸，每个内含子5和和3两端的复合物成对联结，产生两端的复合物成对联结，产生60S的颗的颗粒粒剪接体剪接体（spliceosome），进行）

14、，进行RNA前体分子的剪接。前体分子的剪接。细胞核中的小分子细胞核中的小分子RNA称为称为细胞核小细胞核小RNA（small nuclear RNA, snRNA);位于细胞质中的称为位于细胞质中的称为细胞质小细胞质小RNA (small cytoplasmic RNA, scRNA)。在自然状态下，它们以在自然状态下，它们以核糖核蛋白颗粒（核糖核蛋白颗粒（SnRNP和和scRNP）的形式存在，俗称）的形式存在，俗称snurps和和scyrps。在核仁中也存在着一类小的在核仁中也存在着一类小的RNA，称为，称为核仁小核仁小RNA (small nucleolar RNA, snoRNA),它们

15、在它们在rRNA的加工中的加工中起作用。起作用。snRNA参与剪接过程参与剪接过程，并与其它蛋白一起构成一个大，并与其它蛋白一起构成一个大的颗粒复合体的颗粒复合体,称为称为剪接体剪接体(splicesome)。 由由U1 snRNA以碱基互补的方式识别以碱基互补的方式识别mRNA前体前体5剪接点，由结合在剪接点，由结合在3剪接点上剪接点上游富嘧啶区的游富嘧啶区的U2AF（U2 auxiliary factor）识别）识别3剪接点并引导剪接点并引导U2 snRNP与分支与分支点相结合，形成剪接前体（点相结合，形成剪接前体（pre-spliceosome）。）。 剪接前体进一步与剪接前体进一步与U

16、4、U5、U6 snRNP三聚体相结合，形成剪接体。三聚体相结合，形成剪接体。 真核生物真核生物mRNA前体中内含子剪接过程示意图前体中内含子剪接过程示意图RNA剪接中的两步转酯反应剪接中的两步转酯反应第一步转酯反应是由位于分支位点的保守第一步转酯反应是由位于分支位点的保守腺苷酸的腺苷酸的2-OH引发的。它作为亲核基团攻击引发的。它作为亲核基团攻击5剪接位点保剪接位点保守鸟苷酸的磷酰基团。结果，外显子守鸟苷酸的磷酰基团。结果，外显子3端的核糖与端的核糖与内含子内含子5端磷酸之间的磷酸二酯键被断开，游离出端磷酸之间的磷酸二酯键被断开，游离出来的来的5磷酸则与分支点保守腺苷酸的磷酸则与分支点保守腺

17、苷酸的2-OH连接。连接。因此，除了因此，除了53骨架磷酸二酯键，新的磷酸二骨架磷酸二酯键，新的磷酸二酯键从保守腺苷酸的酯键从保守腺苷酸的2-OH伸出来，产生一个三叉伸出来，产生一个三叉交汇点。交汇点。RNA剪接中的两步转酯反应剪接中的两步转酯反应第二步转酯反应中，第二步转酯反应中，5外显子作为亲核基团，攻击外显子作为亲核基团，攻击3剪接位点的磷酰基团，导致两个结果：一是把剪接位点的磷酰基团，导致两个结果：一是把5和和3外显子连接起来了，二是把内含子作为离去基外显子连接起来了，二是把内含子作为离去基团释放出去。因为内含子的团释放出去。因为内含子的5端已经在第一次转酯端已经在第一次转酯反应中与分

18、支点腺苷酸相连接，所以新释放出来的反应中与分支点腺苷酸相连接，所以新释放出来的内含子形状像一个套索（内含子形状像一个套索（lariat form）。）。哺乳动物细胞中哺乳动物细胞中mRNA前体上的前体上的snRNP是从是从5向向下游下游“扫描扫描”，选择在分支点富嘧啶区，选择在分支点富嘧啶区3下游的下游的第一个第一个AG作为剪接的作为剪接的3受点。受点。AG前一位核苷酸可以影响剪接效率，一般说来，前一位核苷酸可以影响剪接效率，一般说来，CAG=UAG AAG GAG。如果如果mRNA前体上同时存在几个前体上同时存在几个AG，可能发生可能发生剪接竞争。剪接竞争。 在在高等真核生物高等真核生物个体

19、发育或细胞分化过程中个体发育或细胞分化过程中可以有选择性地越过某些外显子或某个剪接点可以有选择性地越过某些外显子或某个剪接点进行进行变位剪接变位剪接，产生出组织或发育阶段特异性，产生出组织或发育阶段特异性mRNA。 脊椎动物中大约有脊椎动物中大约有5%的基因能以这种方式进的基因能以这种方式进行剪接，保证各同源蛋白质之间既具有大致相行剪接，保证各同源蛋白质之间既具有大致相同的结构或功能域，又具有特定的性质差异，同的结构或功能域，又具有特定的性质差异，进而拓展了基因所携带的遗传信息。进而拓展了基因所携带的遗传信息。内含子的变位剪接内含子的变位剪接Alternative Splicing P97/1

20、03P97/103Drosophila DSCAM gene can be spliced in 38,000 alternative ways Different ways of alternative splicing Autosplicing (Self-splicing,自我剪接自我剪接) describes the ability of an intron to excise itself from an RNA by a catalytic action that depends only on the sequence of RNA in the intron.Self-splicing introns -I、II类内含子类内含子带有这些内含子的带有这些内含子的RNA本身具有催化活性，本身具有催化活性，能进行内含子的能进行内含子的自我剪接自我剪接。自由鸟苷酸的自由鸟苷酸的3-OH作为作为亲核基团攻击内含子亲核基团攻击内含子5端端的磷酸二酯键，从上游切的磷酸二酯键，从上游切开开RNA链。链。上游外显子的自由上游外显子的自由3-OH作为亲核基团