激光拉曼光谱介绍

1、武武 汉汉 大大 学学 测测 试试 中中 心心2012. 122013.01光散射现象光散射现象为什么晴朗的天空为什么晴朗的天空呈现蓝色？呈现蓝色？朝霞和晚霞呢？朝霞和晚霞呢？拉曼光谱的发现拉曼光谱的发现印度拉曼研究院印度拉曼研究院 C. V. Raman是印度一位伟大的物理学家，他因为在光散射是印度一位伟大的物理学家，他因为在光散射工作和发现拉曼效应而获得诺贝尔奖，当时他是亚洲第一位获此工作和发现拉曼效应而获得诺贝尔奖，当时他是亚洲第一位获此殊荣的科学家，他同时也作了有关声学、光学、结晶动态学、颜殊荣的科学家，他同时也作了有关声学、光学、结晶动态学、颜色和它们在感知上的研究。色和它们在感知上

2、的研究。拉曼光谱的发现拉曼光谱的发现研究太阳光对苯的散射现研究太阳光对苯的散射现象时的象时的“意外意外”发现发现第一台拉曼光谱仪的第一台拉曼光谱仪的简易光路构型简易光路构型拉曼光谱的基本原理拉曼光谱的基本原理高频高频低频低频v 斯托克斯线和反斯托克斯线对称地分布于瑞利线的两侧，这是由于在上述两种情况下分别相应于得到或失去了一个振动量子的能量。v 反斯托克斯线的强度远小于斯托克斯线的强度，这是由于Boltzmann分布，处于振动基态上的粒子数远大于处于振动激发态上的粒子数。拉曼光谱的基本原理拉曼光谱的基本原理Raman spectrum of CCl4拉曼光谱的基本原理拉曼光谱的基本原理拉曼光谱

3、的基本原理拉曼光谱的基本原理 Avoidance of fluorescence: background-free Raman spectra红外红外 拉曼拉曼分子振动谱分子振动谱吸收，发展较早吸收，发展较早平衡位置附近偶极矩变化不为零平衡位置附近偶极矩变化不为零与拉曼光谱互补与拉曼光谱互补实验仪器是以干涉仪为色散元件实验仪器是以干涉仪为色散元件测试在中远红外进行，不受荧光测试在中远红外进行，不受荧光干扰干扰 低波数（远红外）困难低波数（远红外）困难微区测试较难，光斑尺寸约微区测试较难，光斑尺寸约10微微米，空间分辨率差米，空间分辨率差红外探测器须噪声高，液氮冷却，红外探测器须噪声高，液氮冷却

4、，且灵敏度较低且灵敏度较低多数须制备样品多数须制备样品水对红外光的吸收水对红外光的吸收分子振动谱分子振动谱散射，自激光后才发展散射，自激光后才发展平衡位置附近极化率变化不为平衡位置附近极化率变化不为零零与红外光谱互补与红外光谱互补实验仪器是以光栅为色散元件实验仪器是以光栅为色散元件测试在可见波段进行，有时受测试在可见波段进行，有时受样品荧光干扰，可采用近红外样品荧光干扰，可采用近红外激发激发低波数没有问题低波数没有问题共焦显微微区测试，光斑尺寸共焦显微微区测试，光斑尺寸可小到可小到1微米，空间分辨率好微米，空间分辨率好CCD探测器噪声低，热电冷却，探测器噪声低，热电冷却，灵敏度高灵敏度高无须制

5、备样品，且可远距离测无须制备样品，且可远距离测试试没有水对红外光吸收的干扰没有水对红外光吸收的干扰散射信号量的总计算公式散射信号量的总计算公式拉曼拉曼 10-30 cm2/分子分子红外红外 10-20 cm2/分子分子荧光荧光 10-16 cm2/分子分子拉曼光谱的基本原理拉曼光谱的基本原理灵敏度低灵敏度低I入射入射= (103-105) I瑞利瑞利I瑞利瑞利= (103-106) I拉曼拉曼分子与光子作用截面分子与光子作用截面（Cross-Section) 拉曼光谱的优点和特点拉曼光谱的优点和特点 对样品无接触，无损伤；对样品无接触，无损伤； 样品无需制备；样品无需制备； 快速分析，鉴别各种

6、材料的特性与结构；快速分析，鉴别各种材料的特性与结构； 显微拉曼显微拉曼所须样品量少，且适用样品微区（所须样品量少，且适用样品微区（1 1微米以下光斑）微米以下光斑） 高空间分辨率高空间分辨率( (对包裹体对包裹体, ,金刚石压砧中的样品等尤其有用金刚石压砧中的样品等尤其有用) )， 能适合黑色和含水样品；能适合黑色和含水样品； 高、低温及高压条件下测量；高、低温及高压条件下测量； 光谱成像快速、简便，分辨率高；光谱成像快速、简便，分辨率高； 仪器稳固，体积适中，维护成本低，使用简单。仪器稳固，体积适中，维护成本低，使用简单。拉曼光谱的优缺点拉曼光谱的优缺点优点优点:可以得到高光谱分辨的谱图可

7、以得到高光谱分辨的谱图不受溶剂水的影响不受溶剂水的影响可以方便的改变激发光的波长可以方便的改变激发光的波长缺点缺点: : 灵敏度低灵敏度低 ( (表面吸附物种表面吸附物种) )1 incident photon, 10-6-10共振拉曼光谱共振拉曼光谱RRS 激光共振拉曼光谱（激光共振拉曼光谱（RRS）产生激光频率与待测分子的某个电子）产生激光频率与待测分子的某个电子吸收峰接近或重合时，这一分子的某个或几个特征拉曼谱带强度吸收峰接近或重合时，这一分子的某个或几个特征拉曼谱带强度可达到正常拉曼谱带的可达到正常拉曼谱带的102106倍，并观察到正常拉曼效应中难倍，并观察到正常拉曼效应中难以出现的，

8、其强度可与基频相比拟的泛音及组合振动光谱。以出现的，其强度可与基频相比拟的泛音及组合振动光谱。与正常拉曼光谱相比，共振拉曼光谱灵敏提高，可用于低浓度和与正常拉曼光谱相比，共振拉曼光谱灵敏提高，可用于低浓度和微量样品检测，特别适用于生物大分子样品检测。微量样品检测，特别适用于生物大分子样品检测。 表面增强拉曼光谱表面增强拉曼光谱SERS当一些分子被吸附到某粗糙金属，如金、银、铜的表面时，它们当一些分子被吸附到某粗糙金属，如金、银、铜的表面时，它们的拉曼光谱强度会增加的拉曼光谱强度会增加104106倍，这种不寻常的现象被称为表倍，这种不寻常的现象被称为表面增强拉曼散射效应，简称表面增强拉曼光谱（面

9、增强拉曼散射效应，简称表面增强拉曼光谱（SERS）。）。由于由于SERS有很高的灵敏度，能检测吸附在金属表面的单分子层有很高的灵敏度，能检测吸附在金属表面的单分子层和亚单分子层的分子，又能给出表面分子的结构信息，因此它是和亚单分子层的分子，又能给出表面分子的结构信息，因此它是一种表面研究的有效技术。一种表面研究的有效技术。SERS效应只在少数基体表面能观察到，其中银、金、铜被广泛效应只在少数基体表面能观察到，其中银、金、铜被广泛做为做为SERS的金属基体，它们能显示出很大的增强效应。镍、铝的金属基体，它们能显示出很大的增强效应。镍、铝等少数金属也能显示出一定的增强作用，但增强因子小。等少数金属

10、也能显示出一定的增强作用，但增强因子小。金属表面必须被粗糙化一定程度才能显示出金属表面必须被粗糙化一定程度才能显示出SERS效应。实验还效应。实验还表明，表明，SERS强度与激发光频率、入射角、吸附分子在金属基体强度与激发光频率、入射角、吸附分子在金属基体表面的覆盖度、分子离基体表面的距离等有关。表面的覆盖度、分子离基体表面的距离等有关。 SERS的生物医学应用的生物医学应用Label imagingLabel-free imagingHomogeneous assaysHighly selective (multiplex)Highly sensitiveSimple detection p

11、rocessLimited selectivityPoor universalityLimited sensitivity Unsatisfactory biocompatibility Poor spectral/physical stabilityDifficult modificationHigh spatial resolutionAbundant chemical informationLacking standard databasePoor spectral stabilityFrom single to nano-aggregateDeveloping advanced she

12、ll materialsMulti-targeted imaging共焦显微拉曼谱仪原理共焦显微拉曼谱仪原理 光源针孔的作用是将所形成的点光源成像到焦平面样品上，实光源针孔的作用是将所形成的点光源成像到焦平面样品上，实现了微小的照明区域。由于只有被照明的部分样品散射或反射现了微小的照明区域。由于只有被照明的部分样品散射或反射的光信号才会被接受，所以保证了显微镜的横向空间分辨率。的光信号才会被接受，所以保证了显微镜的横向空间分辨率。在光源照明区域内，但不在焦平面上的样品也会散射或反射光在光源照明区域内，但不在焦平面上的样品也会散射或反射光信号，背景上的杂散光因为处于样品上离焦区域，所以被与光信号

13、，背景上的杂散光因为处于样品上离焦区域，所以被与光源针孔共焦的探测针孔所形成的空间滤波器强烈地衰减。这样源针孔共焦的探测针孔所形成的空间滤波器强烈地衰减。这样对信号的主要贡献是处于焦平面上的样品被显微镜所观察的那对信号的主要贡献是处于焦平面上的样品被显微镜所观察的那一薄层的信号，保证了显微镜的纵向空间分辨率。一薄层的信号，保证了显微镜的纵向空间分辨率。 共焦显微拉曼谱仪原理共焦显微拉曼谱仪原理 共焦拉曼显微镜的工作原理如图所示，即将激光束经入射针孔（共焦拉曼显微镜的工作原理如图所示，即将激光束经入射针孔（1）聚焦于样品表面，样品表面的被照射点在探测针孔（聚焦于样品表面，样品表面的被照射点在探测

14、针孔（2）处成像，其信）处成像，其信号由在号由在2之后的检测器收集（光路如实线所示）；而当激光在样品表面之后的检测器收集（光路如实线所示）；而当激光在样品表面是散焦时，样品处的大部分信号被是散焦时，样品处的大部分信号被2挡住（光路如虚线所示），无法通挡住（光路如虚线所示），无法通过针孔到达检测器。当我们将样品沿着激光入射方向上下移动，可以将过针孔到达检测器。当我们将样品沿着激光入射方向上下移动，可以将激光聚焦于样品的不同层，这样所采集的信号也将来自于样品的不同层，激光聚焦于样品的不同层，这样所采集的信号也将来自于样品的不同层，实现样品的剖层分析。实现样品的剖层分析。 激光共聚焦显微拉曼光谱系统

15、激光共聚焦显微拉曼光谱系统拉曼光谱仪系统组成部分拉曼光谱仪系统组成部分 激光共聚焦显微拉曼光谱系统激光共聚焦显微拉曼光谱系统拉曼光谱仪系统组成部分拉曼光谱仪系统组成部分不同焦长光谱仪的分辨率不同焦长光谱仪的分辨率傅里叶变换拉曼光谱仪傅里叶变换拉曼光谱仪Confocal RamanFT-Raman1. 采用采用1064 nm的的Nd:YAG激光代替了通常的可见激光。激光代替了通常的可见激光。2. 采用采用Michelson干涉仪代替通常的光栅单色器；瑞利散射光的降低采干涉仪代替通常的光栅单色器；瑞利散射光的降低采 用一组滤光片来实现（也称光学过滤），它一般放在干涉仪前。用一组滤光片来实现（也称光

16、学过滤），它一般放在干涉仪前。3. 检测器采用对近红外有灵敏效应的检测器采用对近红外有灵敏效应的Ge二极管和二极管和InGaAs检测器。检测器。D. Bruce Chase，Fourier Transform Raman SpectroscopyJ. Am. Chem. SOC. 1986, 108, 7485-7488傅里叶变换拉曼光谱仪的特点傅里叶变换拉曼光谱仪的特点由于采用近红外激光激发，可避免荧光干扰，扩大拉曼光谱的应用由于采用近红外激光激发，可避免荧光干扰，扩大拉曼光谱的应用范围，有很高的信噪比；范围，有很高的信噪比；用近红外光激发，能量低，可避免样品的光解和热解；用近红外光激发，能

17、量低，可避免样品的光解和热解；傅立叶变换拉曼有分辨率高，波数精确和重现性好的优点。测量精傅立叶变换拉曼有分辨率高，波数精确和重现性好的优点。测量精度可达到度可达到103 cm-1，并且重现性好；，并且重现性好；傅立叶变换拉曼光谱仪的测量速度快，一次扫描可完成全波段扫描傅立叶变换拉曼光谱仪的测量速度快，一次扫描可完成全波段扫描范围测定；范围测定；傅里叶变换拉曼光谱仪操作方便。傅里叶变换拉曼光谱仪操作方便。傅里叶变换拉曼光谱的应用傅里叶变换拉曼光谱的应用聚（对苯撑）对苯二甲酰亚胺（左图）和鸡腿骨组织聚（对苯撑）对苯二甲酰亚胺（左图）和鸡腿骨组织（右图）的可见光拉曼和傅里叶变换拉曼光谱图（右图）的可

18、见光拉曼和傅里叶变换拉曼光谱图激光功率密度问题激光功率密度问题在共聚焦显微拉曼仪器中，激光经显微镜镜头聚焦于采样点，即使使用的激光功率很低，到达样品采样点处的激光功率密度仍然很大。考虑样品的承受能力，激光功率密度不能太高，否则可能由于光热或光解作用而使样品发生变化。方法有:1.采用能量低的激发光采用能量低的激发光2.降低激光功率降低激光功率: 使用衰减片降低激光功率；小倍数的收集透镜3.离焦离焦: 让样品脱离激光聚焦焦点，功率密度即成指数下降9001200150018003 s2 s1 sRaman Shift (cm-1)显微显微:1 mW/1 m2 1 108 mW /cm2常规常规:10

19、0 mW/1mm2 1 104 mW /cm2距离距离( m)直径直径( m)功率密度功率密度拉曼强度拉曼强度01100100106.90.25502516.80.04313rdx-40-30 -20-100102030400.00.20.40.60.81.0Normalized IntensityConfocal depth (m)离焦方法原理离焦方法原理900120015001800302010 d (m)0Raman Shift (cm-1)离焦防止光解的例子离焦防止光解的例子镜头的选择镜头的选择 共聚焦拉曼谱仪通常备有几个不同放大倍数或数值孔径的镜共聚焦拉曼谱仪通常备有几个不同放大倍数

20、或数值孔径的镜头。要结合不同的实验要求，综合收集效率，空间分辨率及工作头。要结合不同的实验要求，综合收集效率，空间分辨率及工作距离等几个因素使用相应的镜头：距离等几个因素使用相应的镜头： 如果需要高的如果需要高的空间分辨率空间分辨率则应选择高放大倍数的镜头；如则应选择高放大倍数的镜头；如50、100的镜头的镜头 对于易挥发，腐蚀性样品的测试则应选择长工作距离的镜头，对于易挥发，腐蚀性样品的测试则应选择长工作距离的镜头，并且一般还要用并且一般还要用PVC或或PE薄膜包裹来保护镜头，或者可以在样品薄膜包裹来保护镜头，或者可以在样品上方加窗片来隔离，一可以有效的防止暴露在空气而受到污染上方加窗片来隔

21、离，一可以有效的防止暴露在空气而受到污染,二二也可以有效的保护镜头也可以有效的保护镜头 如果要高的光如果要高的光收集效率收集效率，则选择数字孔径大（通常倍数是高的，则选择数字孔径大（通常倍数是高的放大倍数）的镜头；具体考虑如下：放大倍数）的镜头；具体考虑如下：是显微镜物镜是显微镜物镜和和的能力的能力NA=nsin n:镜头前空间中介质的折射率，镜头前空间中介质的折射率， ：镜头孔径张角的一半镜头孔径张角的一半增大增大NA的方法：的方法：a. 油浴大的油浴大的n值值b. 高倍镜头大的高倍镜头大的 值值c. 盖玻片校正调整光行差盖玻片校正调整光行差fDNA大NA小 数值孔径数值孔径检测器的优化检测

22、器的优化强度与灵敏度的选择强度与灵敏度的选择,信号的信号的binning处理，处理，pinhole，slit的设置，的设置， CCD区域的设定区域的设定-强度与灵敏度是矛盾的统一强度与灵敏度是矛盾的统一当检测弱信号时软件提供一种当检测弱信号时软件提供一种binning的方法，即牺牲谱图的分的方法，即牺牲谱图的分辨率合并几个象素信号的方法来提高信号强度。因此这就要考虑辨率合并几个象素信号的方法来提高信号强度。因此这就要考虑我们的实验目的，关注的是强度还是光谱的分辨率，从而选取合我们的实验目的，关注的是强度还是光谱的分辨率，从而选取合适的适的binning；还有一种提高强度的方法即加大还有一种提高

23、强度的方法即加大pinhole和和slit，这就减弱了共焦，这就减弱了共焦性能，损失了空间分辨能力。而且性能，损失了空间分辨能力。而且pinhole和和slit也有一个最佳值，也有一个最佳值，超过这个数字的加大毫无意义；超过这个数字的加大毫无意义；CCD区域的设定要根据拉曼光在区域的设定要根据拉曼光在CCD上的成像位置来确定，选上的成像位置来确定，选定的定的CCD区域必须包括成像区域，太窄会丢失所需的信号，太宽区域必须包括成像区域，太窄会丢失所需的信号，太宽则使噪音增加。则使噪音增加。入射收集方式和样品处理入射收集方式和样品处理样品状态处理，固体，液体的样品浓度样品状态处理，固体，液体的样品浓度 拉曼散射截面极小，要提高谱图质量，不仅在仪器上要提高各拉曼散射截面极小，要提高谱图质量，不仅在仪器上要提高各个元件的性能，优化采谱参数，还应尽量提高采谱体积内