分子生物学试验课考试

1、分子考试资料整理1 .质粒DNA勺构型与电泳速率的关系？答：DN吩子的迁移速率取决于由DN的子的大小与构型而形成的分子筛效应。在相同的构型下，DN的子迁移速率与其相对分子量成反比。相同分子量但不同构型的DNA分子迁移速率不同。当琼脂糖凝胶的浓度较低时，电泳速率为：超螺旋DNA线性DN*开环DNA2 .碱裂解法提取质粒DNA勺原理以及三种溶液的作用？基本原理质粒的分离是利用质粒DNAt染色体DNAS变性与复性中的差异来达到的目的。当菌体在NaOHffiSDS容液中裂解时，蛋白质与DN侬生变性，由于染色体DNA与质粒DNA5朴构型不同，染色体DN做螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA勺氢键虽被断裂，

2、但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后，溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNAS性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNARNAR蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA三种溶液的作用（溶液I,50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA,pH8.0;溶液II,0.2NNaOH/1%SDS（新鲜的）；溶液III,3M醋酸钾/2M醋酸。）溶液I:Tris-Cl:适当pH值，葡萄糖：增加溶液的粘度，

3、维持渗透压，防止DNAS机械剪切力作用而降解，悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，EDTA:抑制DNase的活性，和抑制微生物生长（是Ca2拜口Mg2将二价金属离子的螯合剂）溶液II:NaOH是最佳的溶解细胞的试剂。这一步要记住两点：第一，不能用旧的NaOH第二，时间不能过长，必须温柔混合，不然基因组DNAa会断裂。SDS:是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-R+-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。溶液III:醋酸钾：K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐

4、并与蛋白质形成沉淀而除去；高浓度的盐，使得沉淀更完全（在pH为8左右的溶液中，DN砌子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或KAG使Na”和DN的子上的负电荷，减少DNA子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNAft盐沉淀）。2 M的醋酸：中和NaOH创造质粒复性的环境。3 .感受态细胞制备过程应注意的问题；细胞的生长状态和密度最好从-70C甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5X107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600（0.4-0.5）控制。（应注意OD600S与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同

5、；受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。质粒DNA勺质量和浓度一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低；重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10-100倍。整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿及试剂都要灭菌。用纯的试剂，注意防止被其它试剂、DNA1或杂DNA0f污染整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴CaCl2处理后细胞很脆，动作要轻，慢。化合物及无机离子的影响：在Ca2+勺基础上联合其

6、他二价金属离子（如Mn2碱Co2+）、DMSOE还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；4 .挖胶过程应注意什么？保证切下的条带没有外源DNA勺污染。切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积。切胶时尽量在长波长下进行，减少紫外对DNA勺损伤。为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，可采用薄而宽的梳子来跑胶。5 .如何灭活RNasdA.RNase灭活剂焦磷酸二乙酯（DEPC:是一种强烈但不彻底的RNABB抑制齐以它通过和RNABB的活性基团组氨酸的咪唾环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 异硫鼠酸月瓜：目前被认为是最有效的RN服抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA&

7、#187;失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNAR有强烈的变性作用。 氧铀核糖核昔复合物：由氧化铀离子和核昔形成的复合物，它和RN/W结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RN丽的活性。RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）:从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNABI的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNABI结合，使其失活。其它：SDS尿素、硅藻土等对RNAS也有一定抑制作用。B.RNase灭活剂C.玻璃器皿200c高温烘烤2小时D.塑料器皿焦炭酸二乙酯（DEPC水溶液处理。6 .提取RNAF口DNA寸所用的饱和酚有什么不同？水饱和酚又叫水平衡酚。水饱和

8、酚的PH、于7,一般是PH为5.0左右，通常与异硫氢酸月瓜一起使用，用于细胞RNA勺提取，在酸性环境中，DNAS酚相，RNAft水相。两者就分开了。Tris饱和酚一般PH大于7.8,用于DNA勺提取。其中，酚是强的蛋白变性剂，可以使细胞或组织中的蛋白质变性析出。由于PH值大于7,在碱性环境中DNAa于水相，RNA处于有机相。从而分离上清，即可得到DNA7 .如何减少蛋白诱导过程中包涵体的产生？降低诱导温度，一般15-25C降低诱导剂ITPG浓度使用中等强度或弱的启动子进行融合表达增加蛋白质折叠的添加剂与伴侣分子和折叠酶共表达选择突变的菌株优化培养基条件8 .单酶切时，为提高连接效率应采取什么措

9、施？为什么？通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其5'末端的磷酸基，防止环化，通过连接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。9 .连接反应中，插入片段与载体的合适比例是多少？载体与目的基因摩尔数之比为1:3-5如果插入片段较小，而载体较大，和载体的摩尔比例3-6:1连接效果好，如果载体和插入片段大小相近，摩尔比1:1较好；如果插入片段和载体的摩尔比例过大，会导致多克隆的插入；如果插入片段和载体的摩尔比例过小，会导致假阳性增多。9,筛选阳性克隆的方法？菌落PCR酶切鉴定、Crackinggel、菌落原位杂交、测序10 .蓝白斑筛选的原理是什么？如何出现大量蓝斑，可能是什么原因？蓝白

10、斑筛选是重组子筛选的一种方法：许多载体（PUCff列）都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有B-半乳糖甘酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS。受体菌含编码B-半乳糖甘酶C端aa序列。当无外源基因插入时，载体表达的N端B-半乳糖甘酶多肽与受体菌表达的C端B-半乳糖甘酶多肽功能互补，具有B-半乳糖甘酶活性。可以将生色底物X-gal分解成蓝色物质，从而在培养基中形成蓝色菌落。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，造成插入失活，而使表达的产物不具有B-半乳糖甘酶活性，不能分解底物X-gal,使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。原

11、因：1）载体与目的基因连接做的不好，重组质粒太少，大量的自连载体进入感受态细胞。2）酶切不完全，未被酶切的空载体进入感受态细胞。11 .已知一个基因的核酸序列，如何进行蛋白表达？步骤？目的基因的获取：提取RNA反转录成cDNA以cDNAJ模板，根据核酸序列设计引物，PCRT增目的基因克隆载体的选择与构建：提取质粒DNAD重组质粒的构建，即外源基因与表达载体的连接：双酶切，电泳检测，切胶回收目的片段，连接，获得重组质粒。重组DNA1入受体菌：转化，将重组质粒导入受体菌重组体的筛选：用菌落PC时法筛选阳性克隆，并将阳性菌落保存留种。克隆基因的表达：先将菌种复苏、扩繁；用IPTG分别诱导阳性克隆菌和

12、空载体菌；取适量蛋白样，处理好后，上样、跑胶，染色、脱色、拍照。观察重组蛋白的表达情况。a.对于阳性克隆菌，向5ml菌液中加入IPTG至终浓度0.6mM（30ul0.1MIPTG）,继续震荡培养；b.对于空载体菌，向5ml菌液中加入30ul0.1MIPTG（终浓度0.6mMIPTG）;12 .质粒的特点是什么？结构：大多为共价、闭合环状、超螺旋（circularcovalentlyclosedDNA,cccDNA）功能：正常生长非必须的，但赋予细菌某些性状特征（具有遗传标记）复制和遗传：细菌内的共生型遗传因子，其复制独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。可以转移13 .PCR

13、的原理是什么？PCFW序通常有哪几个步骤？聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction,PCR是模才H体内DNA的复制过程，在体外特异性扩增DNAt段的方法，从而获彳#大量的同一序列DNA每经过一轮扩增，模板分子数增加一倍，经过n次循环后，模板分子数变为原来的2n倍。步骤：PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA勺变性：模板DNAS加热至93c左右一定时间后，使模板DNA®链或经PCRT增形成的双链DNAS离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNAf引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55c左右，引物与模板

14、DNAI链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNAK合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。14 .当两种限制酶反应条件不同时，若要用双酶切，应采取什么措施？答：要避免星活性及部分酶切。（1）先用低盐缓冲液中活性最高的酶切，再补盐和第二种酶；（2）用一种酶消化后，以酚：氯仿：异戊醇抽提，再经乙醇沉淀，将DNA1新溶解与

15、适合第二种酶的缓冲液，加第二种酶消化；（3）先低温酶，后高温酶；（4）使用通用缓冲液。15 .大肠杆菌转化（CaCl2法）的原理？0C下，细菌处于CaCl2的低渗溶液中，菌体细胞膨胀成球形，DNAWCaCl2形成羟基-钙磷酸复合物，粘附于细胞表面，经42c短时间热击处理，促使细胞吸收DNAM合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子基因得以表达，在抗生素选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。16 .感受态细胞制备及转化中的影响因素？细胞的生长状态和密度最好从-70C甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5

16、X107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600（0.4-0.5）控制。（应注意OD600S与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同；受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。质粒DNA勺质量和浓度般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低；重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10-100倍。整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿及试剂都要灭菌。用纯的试剂，注意防止被

17、其它试剂、DN服或杂DNA0f污染整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴CaCl2处理后细胞很脆，动作要轻，慢。化合物及无机离子的影响：在Ca2+勺基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+ECo2+）、DMS城还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；17 .CaCl2法制备感受态细胞转化DNA寸，低温的主要目的是什么？热休克温度和目的是什么？低温目的：（1）抑制细胞的旺盛生理代谢；（2）有助于DN好Ca2+附于细胞表面（3）防止DNAas拼解DNA。热休克温度是42C；目的是使细胞摄入吸附于其表面的DNA18 .影响PCFT增的因素有那些？引物的质量与特异性；PCR1环条

18、件（退火温度）；Mg2+ft度；模板DNAB质量；酶的质量。19 .引物设计的基本原则？引物长度一般在1825碱基之间。避免引物内和引物之间的二级结构两个引物的Tm值要接近。G+C含量在40%60无间，避开局部富含GCEAT,3'端避开ATrich结构碱基要随机分布。引物之间不能有连续4个碱基的互补，特别是3'末端的3个碱基。引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。引物5'端可以修饰，引物3'端不可修饰。20.SDS-PAGE勺原理？SDS是一种阴离子表面活性剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的构象。蛋白质分子与S

19、DS充分结合。PAGES丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（简称Bi）在加速剂NNN'N'-四甲基乙二胺（简称TEMED口催化剂过硫酸钱（简称AP）或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。21.SDS-PAGEE&泳的速率为什么只与蛋白的分子量有关，而与所带电荷多少无关？蛋白质分子与SDS充分结合后，所带的SDS的负电荷远远大于蛋白质本身的电荷量，因而就掩蔽或消除了不同种类蛋白质分子间的电荷差异对电泳迁移率的影响。电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量。22.提取RNAd程中，怎样才能有效地降低材料本身给RNA®取带来的

20、降解？ 新鲜细胞：如果试剂没有问题，且外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。 新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品（如肝脏，胸腺等），即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。 冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70C冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70C冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNAt比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以

21、研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。 外源RNA1的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA1进入实验系统。内源RNAS的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高23 .异硫氟酸弧法提取RNA勺原理？异硫鼠酸月瓜可以裂解细胞释放出核酸，并同时使蛋白质变性，抑制内源的RNase活性。在酸性条件下（NaAcpH4.0）,RNA容于水相，而DNA容于有机相。这样，在加入苯酚/氯仿后，RNA溶于上层水相中，而DNA容于下层苯酚/氯仿中，蛋白处于中间层。含有RNA勺水相被转移出来以后，在异丙醇的作用下

22、沉淀，从而被分离出来。24 .理想状态下DNARNAOD260/28处别为多少？在什么范围比较合适？偏大或偏小分别说明什么？基因组DNA1.7<OD260/OD280<1.9质粒DNAOD260/280:1.8-2.0;DNA:1.8(RNA:2.0),比值<1.8:蛋白质污染；比值>2.0:RNA污染理想的RNA2.0,OD260/280在1.9-2.1之间。比值如果过低，可能有蛋白质污染，过高RNAT能已发生降解。如果OD260/OD28M低（1.7）,通常可以通过减少组织和细胞的用量来实现。OD260/OD280：匕值偏低？蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。

23、减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280：匕值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD260/OD280:匕值偏低。因此，从这类材料中提取RNAM,需要注意多糖、多酚杂质的去除。设备限制：测定OD260ROD28O值时，要使OD260实数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测ODfi时，对照及样品稀释液请使

24、用10mMTris,pH7.5或TE。用水作为稀释液将导致比值偏低。25 .基因组DNAS取的一般原理？如何判断基因组DNA勺浓度和质量？将分散好的真核生物组织细胞在含SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚：异戊醇抽提的方法去除蛋白质，得到的DNAg乙醇沉淀或透析等方法进一步纯化。紫外分光光度法OD280;琼脂糖凝胶电泳基因组DNA勺质量检验：紫外分光光度法OD260/280;OD260/23Q酶切法（HindIII）、完整性检测：基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象。26 .提取基因组DNA勺用途有哪些？构建基因组文库、Southern杂交、RFLP

25、基因克隆（PCR、制作基因芯片27 .提取基因组DNAff用试齐1J:组织消化液（100ml）:5ml1MTris-HCl、4ml0.5MEDTA2ml10%SDS、150ul60mg/mlProteaseK;Tris饱和酚；酚/氯仿（1:1）;氯仿；无水乙醇；70%乙酉5MNaCl;TE28 .RNase的来源？样品、试剂、多次使用的器皿、手、说话产生的唾沫、空气29 .RNase酶注意事项玻璃器皿处理：量筒、试剂瓶等玻璃器皿须200c烘烤2小时以上。塑料器皿处理：0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC水溶液处理，再用蒸储水冲净。试剂处理：实验用的所用试剂也可用DEPCt理，加入DEPCg终浓度0.

26、1%,然后剧烈震荡混匀10分钟，然后高压灭菌以消除残余的DEPC专用的RNAM乍室、专用器械。操作时戴口罩、帽子、手套一般情况下采用用DEPCE制的70猿醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。注意：DEPCf氨水混合后会产生致癌物，须小心在通风柜中使用。30 .组织和细胞样品收集，保存？组织样品收集后，需要立即保存在液氮中（1min）,或在样品中加入一定量的保护剂，有一些商业化的产品可以选用（RNAlater,RNAstore）。一般实验收集50-100mg组织就足够了。31 .RNA保存（-80C）:DEPC-H2O0.1mMEDTATE（10mMTris,1mMEDTA）32 .如何估计

27、RNA勺产量？RNA勺含量与组织和细胞的类型有比较大的关系，同时与抽提的方式有关mRNA勺含量一般占总RNAt量的2-5%样品如果低于20m©10000个细胞，在抽提时需要考虑加入合适的RNAK淀载体。电泳，加RNAmarker来定量紫外分光光度计（OD260,通常0.5-1.5ug/ul比较合适33 .常用的RNAS取方法？异硫氟酸月瓜法、盐酸月瓜法、RNAzol法；Trizol是一种新型总RNAtt提试剂，内含异硫鼠酸月瓜等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。Trizol试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。34.SolutionD的成分及其作用？4M异硫氟酸”瓜（

28、裂解细胞，抑制RNase25mM宁檬酸钠，pH7.0（缓冲液）0.5%十二烷基肌酸钠（裂解细胞，抑制RNaseDEPCK配制35 .Trizol法提取昆虫中肠总RNA!要的试剂：氯仿：异戊醇(24:1)、异丙醇、75%L酉I(in?DEPC-treated?water)、RNase?free水或0.5%?SDS溶液准备不含RNase的水，将其装入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate?(DEPC)?to?0.01%?(v/v)。静置过夜，然后高压灭菌。0.5%?SDS溶液必须用DEPC8处理、高压灭菌的水。36 .昆虫中肠总RNA勺提取组织匀浆、相分离、沉淀RN

29、A洗涤RNA沉淀再溶解、RNA佥测37 .RNA提取注意事项在提取液中加入琉基乙醇对降低酚类的干扰可能有所帮助在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。溶于TE的核酸储藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸样品保存时要求以高浓度保存，低浓度的核酸样品要比高浓度的更易降解。在抽提过程中，若蛋白质含量或其它的杂质还较多，可以增加抽提次数。提取RNA青尽量在低温下操作。38 .如何提高RNAS取效率？充分匀浆，以分散细胞；选择合适的提取方法；选择新鲜的组

30、织；选择合适的样品储存条件；避免内源和外源Rnase的污染；正确的沉淀方法：乙醇沉淀：0.1倍体积的5MNH4Ac+2-2.5倍体积的无水乙醇，-20C>25min;异丙醇沉淀：0.6-1倍体积的异丙醇。39 .mRNA勺分离纯化：采用OligodT-纤维素，从总RNA分离出mRNA该法利用mRNA3'末端有Poly(A)的特点，在总RNA流经寡聚(dT)-纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNAt特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度洗脱时，mRN微洗脱下来。一般而言，经过二次OligodT柱后，可得到较高纯度的mRNA40 .核酸的贮存DNAR存：1)短期贮存：4c或-20C

31、存放于TE(Tris和EDTA缓冲?中。TE缓冲液(PH为8),可减少DNA兑氨反应；EDTA<以制DNase的活性。2)长期贮存：TE缓冲?中-70C保存数年；41 .提取基因组DNAt要试剂的作用:EDTA:二价金属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性SDS的作用：溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂；溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；对RNADNAB有抑制作用；与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性蛋白酶K：水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质；蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能力，而且在SDSEDTA在时仍保持较高活性，可同时使用。苯酚的特点：蛋白质强变性

32、剂、抑制DNAB活性；苯酚溶于有机溶剂，微溶于水；提取DNA前苯酚用Tris-Hcl饱和，防止吸收过多DNA降低DNA的损失率；氧化苯酚会破坏DNA42 .为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA勺分离？苯酚在空气中经常被氧化生成酶，它能够产生自由基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，造成DN僻解。氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl饱和酚，并调节至中性。PH8.0的Tris溶液可以使的抽提出的DNA8入水相，减少在蛋白质层滞留。在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。无水乙醇沉淀：沉淀前往往加入NaCl等盐离子，

33、作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNAC淀析出。43 .一个合格表达载体的组成要素：复制起始位点Ori。即控制复制起始的位点。原核生物DN砌子中只有一个复制起始点。而真核生物DN砌子有多个复制起始位点。抗生素抗性基因。可以便于加以检测，如Amp+,Kan+多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段P/E启动子/增强子Terms终止信号加poly(A)信号可以起到稳定mRN肺用44 .原核表达系统中的各因素：复制子：通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关筛选标记和报告基因：氨芳青霉素，卡那霉素启动子：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一组成型表达：组成型启动子诱导调控型表达：IPTG融合表达：GST,His-tag分泌表达：信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜可溶性表达：转录终止子：控制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降核糖体结合位点：多数载体启动子下游都有SD序列表达菌株：不同的表达载体对应有不同的表达菌株45 .对原核表达载体应该注意3点：选择合适的启动子及相应的