RNA的制备及纯度的鉴定ppt课件

1、生物制药生物制药09303第七组第七组指点教师：陈芬指点教师：陈芬一一 操操 作作 方方 法法6.思索问题思索问题5.本卷须知本卷须知4.工艺过程工艺过程3.仪器试剂仪器试剂2.根本原理根本原理1.背景知识背景知识RNA的制备及的制备及纯度的鉴定纯度的鉴定背景知识背景知识 核糖核酸，简称核糖核酸，简称RNA，主要以单链的方式存在于生物体内，主要以单链的方式存在于生物体内,其高级构造很复杂其高级构造很复杂,它们既担负着贮藏及转移遗传信息的功能它们既担负着贮藏及转移遗传信息的功能,又能作为核酶在细胞内发扬代谢功能。生物体内共有三种又能作为核酶在细胞内发扬代谢功能。生物体内共有三种RNA，即编码特定

2、蛋白质序列的信使，即编码特定蛋白质序列的信使RNA；能特异；能特异性解读性解读mRNA中的遗传信息、将其转化成相应氨基酸后参与多肽链中的转运中的遗传信息、将其转化成相应氨基酸后参与多肽链中的转运RNA；直接参与核糖体中蛋白质合成的核糖体；直接参与核糖体中蛋白质合成的核糖体RNA。 mRNA的选择性拼接 合成类RNA RNA的生物合成 RNA/DNA诊断仪实验目的 1 掌握从动物组织中提取掌握从动物组织中提取RNA的根本原理和操作的根本原理和操作 2 掌握掌握RNA纯度鉴定的原理和根本操作纯度鉴定的原理和根本操作 3 进一步熟习可见分光光度计的运用进一步熟习可见分光光度计的运用实验原理 细胞内大

3、部分细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一同，以核蛋白的均与蛋白质结合在一同，以核蛋白的方式存在。因此分别方式存在。因此分别RNA时必需使时必需使RNA 与蛋白质解离，与蛋白质解离，并除去蛋白质。并除去蛋白质。 最常用含水的酚溶液除去蛋白质，去污剂和酚均能抑制最常用含水的酚溶液除去蛋白质，去污剂和酚均能抑制RNA酶活力，有利于制备核酸大分子，以酚水两相系统分酶活力，有利于制备核酸大分子，以酚水两相系统分别别RNA是将细胞或细胞器置于含有是将细胞或细胞器置于含有SDS的缓冲盐溶液中的缓冲盐溶液中，加等体积水饱和的酚，经过猛烈振荡，然后离心构成上，加等体积水饱和的酚，经过猛烈振荡，然后离心构成上层

4、水相和下层酚相。层水相和下层酚相。 实验所用的实验所用的0.15mol/L缓冲盐溶液系统可使大部分核糖核缓冲盐溶液系统可使大部分核糖核蛋白解离，在用酚处置时脱氧核糖核蛋白变性；在低温条蛋白解离，在用酚处置时脱氧核糖核蛋白变性；在低温条件下，从水相中除去，这样得到的件下，从水相中除去，这样得到的RNA 制品中混杂的制品中混杂的DNA量极低量极低 RNA制品继续用氯仿异戊醇处置，可以进一步除去其制品继续用氯仿异戊醇处置，可以进一步除去其中含有的少量蛋白质。最后用乙醇使中含有的少量蛋白质。最后用乙醇使RNA自水溶液中沉淀自水溶液中沉淀下来。下来。 实验所得制品的核酸含量可用地衣酚显色法测定实验所得制

5、品的核酸含量可用地衣酚显色法测定RNA含含量量 。RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，构成的核糖继与浓盐酸共热时，即发生降解，构成的核糖继而转变为糠醛，后者与而转变为糠醛，后者与3，5-二羟基甲苯地衣酚反响二羟基甲苯地衣酚反响呈鲜绿色，该反响需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反响呈鲜绿色，该反响需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反响产物在产物在670nm处有最大吸收。处有最大吸收。RNA在在20250 g范围内，范围内，光吸收与光吸收与RNA的浓度成正比。的浓度成正比。实验器材与试剂器材：乳钵器材：乳钵 、磨口、磨口 具塞锥形瓶具塞锥形瓶(500ml) 天平天平 、 离心离心 机机4000rpm动物肝脏

6、动物肝脏 、紫外可、紫外可见分光度计、恒温水浴锅见分光度计、恒温水浴锅试剂：试剂：1.SDS-缓冲盐溶液缓冲盐溶液0.3%SDS-0.1mol/L氯化钠氯化钠 -0.05mol/L，pH5.0乙酸盐缓冲液称取乙酸盐缓冲液称取1.5gSDS，2.92g氯化钠，氯化钠，2.05g乙酸钠乙酸钠溶于水中，用乙酸调至溶于水中，用乙酸调至pH5.0，最后定容至，最后定容至 500ml。2.含水酚液：运用前将苯酚重蒸含水酚液：运用前将苯酚重蒸(酚的沸点为酚的沸点为181.8)并用并用SDS缓缓冲盐溶液使其饱和。冲盐溶液使其饱和。3.氯仿氯仿-异戊醇液：氯仿：异戊醇异戊醇液：氯仿：异戊醇=24:1(V/V)。

7、4.含含2%乙酸钾的乙酸钾的95%乙醇溶液。乙醇溶液。5.75%乙醇，乙醇，95%乙醇、无水乙醇。乙醇、无水乙醇。6.乙醚乙醚7.RNA规范溶液须经定磷确定其纯度：取酵母规范溶液须经定磷确定其纯度：取酵母RNA配成配成200 g/mL的溶液。的溶液。8.地衣酚试剂：先配制地衣酚试剂：先配制0.1%三氯化铁的浓盐酸分析纯溶液，实三氯化铁的浓盐酸分析纯溶液，实验前用此溶液作为溶剂配成验前用此溶液作为溶剂配成 0.1%地衣酚溶液。地衣酚溶液。实验步骤 一一.实验前的预备实验前的预备 mRNA的分子构造容易遭到的分子构造容易遭到RNA 酶的攻击反响而酶的攻击反响而降解降解,加上加上RNA 酶极为稳定而

8、且广泛存在酶极为稳定而且广泛存在,因此在因此在提取过程中应严厉防止提取过程中应严厉防止RNA 酶的污染并设法抑制酶的污染并设法抑制其活性。其活性。 所用的玻璃器皿需求置于枯燥烘箱中所用的玻璃器皿需求置于枯燥烘箱中 200.0C烘烘烤两小时以上烤两小时以上,凡是不能用高温烘烤的资料如塑料凡是不能用高温烘烤的资料如塑料容器等可用容器等可用0.1%的焦碳酸二乙酯的焦碳酸二乙酯DEPC水溶水溶液处置，再用蒸馏水冲净。液处置，再用蒸馏水冲净。RNA提取流程2克动物肝脏组织克动物肝脏组织加加20mlSDS缓冲盐溶液缓冲盐溶液倒入磨口具塞锥形瓶倒入磨口具塞锥形瓶室温猛烈震荡室温猛烈震荡10分钟分钟研碎研碎加

9、同体积含水酚溶液加同体积含水酚溶液水浴分层并离心水浴分层并离心得上清液得上清液加氯仿异戊醇震荡加氯仿异戊醇震荡离心取上清液离心取上清液放置沉淀离心放置沉淀离心洗涤沉淀离心枯燥洗涤沉淀离心枯燥将将RNA溶于蒸馏水溶于蒸馏水离心得粗品离心得粗品加加2%乙酸钾乙醇溶液乙酸钾乙醇溶液 二二.实验过程实验过程 1.取取2g动物肝脏组织，剪成小块，在乳钵种研碎动物肝脏组织，剪成小块，在乳钵种研碎，加，加20mLSDS-缓冲盐溶液见试剂缓冲盐溶液见试剂1.使成均使成均浆，倒入磨口具塞锥形瓶内，再加同样体积的含浆，倒入磨口具塞锥形瓶内，再加同样体积的含水酚溶液，室温下猛烈振荡水酚溶液，室温下猛烈振荡10分钟。

10、分钟。 2.置冰浴中分层，在置冰浴中分层，在0-4下，以下，以4000rpmn离心离心15分钟。吸出上清液，加等体积氯仿异戊醇，分钟。吸出上清液，加等体积氯仿异戊醇，室温下猛烈振荡室温下猛烈振荡10分钟，以分钟，以4000rpm离心离心5分钟分钟，或在室温下放置，或在室温下放置10分钟使分层。吸出上清液分钟使分层。吸出上清液假设有必要，该操作可反复多次，加假设有必要，该操作可反复多次，加2倍体积倍体积2% 乙酸钾的乙醇溶液，在冰浴中放置乙酸钾的乙醇溶液，在冰浴中放置1小时使小时使RNA沉淀，此沉淀液可在冰箱内较长期存放。沉淀，此沉淀液可在冰箱内较长期存放。 3.假设要得到枯燥制品，可将沉淀液以

11、假设要得到枯燥制品，可将沉淀液以4000rpm离心离心10分分钟，倾去上清液。沉淀用少许钟，倾去上清液。沉淀用少许75%乙醇、乙醇、95%乙醇、无水乙醇、无水乙醇各洗乙醇各洗1次，同上法离心，倾去乙醇后，空气枯燥。次，同上法离心，倾去乙醇后，空气枯燥。 4.将将RNA准确称取准确称取30mg左右左右RNA枯燥制品溶于枯燥制品溶于510mL蒸馏水中，离心除去不溶性杂质，得蒸馏水中，离心除去不溶性杂质，得RNA粗品。粗品。 5.RNA纯度的鉴定纯度的鉴定 一、一、RNA规范曲线的制定规范曲线的制定取取8支试管，编号，按表参与试剂。加毕，摇匀，置沸水支试管，编号，按表参与试剂。加毕，摇匀，置沸水浴中

12、加热浴中加热15min，冷却，测，冷却，测OD670值。以值。以OD670值为纵值为纵坐标，坐标，RNA含量含量ug/ml为横坐标绘制规范曲线。为横坐标绘制规范曲线。 二、制品的测定二、制品的测定取取0.20.5ml制品液于试管中，加蒸馏水稀释至制品液于试管中，加蒸馏水稀释至2ml，然后加，然后加2ml地衣酚试剂摇匀，于沸水中煮沸地衣酚试剂摇匀，于沸水中煮沸15分钟，冷却，测分钟，冷却，测OD670。根据测得的吸光度，从规范曲线上查出相当该吸光度的。根据测得的吸光度，从规范曲线上查出相当该吸光度的RNA的含量。的含量。 三、三、 RNA含量的计算含量的计算根据测得的光吸收值，从规范曲线上查出相

13、当该光吸收值的根据测得的光吸收值，从规范曲线上查出相当该光吸收值的RNA含量。按下式计算出制品中含量。按下式计算出制品中RNA的百分含量：的百分含量：样品液样品液RNA含量含量(ug/ml)=规范曲线查到的值规范曲线查到的值稀释倍数稀释倍数%10010gmLg/mLRNA6）新鲜肝重（）总体积（）含量（样品液质量分数RNA操作参照表本卷须知1：在操作中当参与变性剂氯仿后，为了保证核酸样品：在操作中当参与变性剂氯仿后，为了保证核酸样品的完好性，操作要轻，尤其在提的完好性，操作要轻，尤其在提DNA时，更要防止时，更要防止猛烈操作猛烈操作2：在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强：在沉淀核酸时

14、可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以普通用于异丙醇，所以普通用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分抑制这种污染，白含量高时，用异丙醇沉淀可部分抑制这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。染更为有效。 3：在提取核酸时，如样品浓度低，那么应添加有机：在提取核酸时，如样品浓度低，那么应添加有机溶剂沉淀时间，溶剂沉淀时间，70下下30min;20过夜将有助过夜将有助于添加核酸的沉淀量。于添加核酸的沉淀量。 4: RNA通常用分光光度计定量，丈量在通常用分光光度计定量，丈量在260

15、 nm处的处的吸收值吸收值A260。通常分光光度计。通常分光光度计A260的读数要介的读数要介于于0.15-1.0之间才是可靠的，因此之间才是可靠的，因此RNA提取终了后，提取终了后，要根据大约产量稀释到适当浓度范围，再用分光光度要根据大约产量稀释到适当浓度范围，再用分光光度计丈量。计丈量。A260为为1相当于相当于RNA的浓度为的浓度为40 g/ml。问题及答案 一、提取制备一、提取制备RNA常用的方法有那几种？常用的方法有那几种？ 主要有苯酚、异硫氰酸胍、主要有苯酚、异硫氰酸胍、CTAB、LiCl密度密度梯度、梯度、Trizol等方法。等方法。 二、制备二、制备RNA应留意哪些问题应留意哪些问题. 1.整个过程应留意预防整个过程应留意预防RNA酶的污染酶的污染 2.匀浆后加氯仿之前样品可以在匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至至-70保管保管至少一个月。至少一个月。 三、地衣酚反响中，干扰三、地衣酚反响中，干扰RNA的测定要素有哪些的测定要素有哪些？如何能减少他们的影