血流感染实验室诊断（课堂PPT）

1、1血流感染实验室诊断新进展血流感染实验室诊断新进展北京协和医院检验科王瑶2013年4月13日2内容 什么是血流感染？ 血流感染流行病学特点 血培养流程优化 提高阳性率 分析培养结果 减少污染 分子生物学方法检测血流感染 基于PCR的技术 MALDI-TOF MS PNA-FISH3概念 感染炎症+病原体 全身炎症反应综合征（SIRS） 体温38C或90次/分 呼吸频率20次/分，或PaCO212109/L或10% 脓毒血症（sepsis）感染+SIRS，血培养可以阳性或阴性 重度脓毒血症（severe sepsis）sepsis+脏器功能障碍、组织灌注不良和低血压 感染性休克（septic s

2、hock）4概念 败血症（septicemia）：病原菌及其毒素侵入血流所引起的临床综合征，是一种严重的全身感染。病原菌主要是细菌，也可为真菌、分枝杆菌等。 菌血症（bacteremia）：细菌在血流中短暂出现的现象，一般无明显毒血症状，在国外文献中常与败血症通用。 血流感染（bloodstream infection, BSI）：败血症和菌血症目前统称为血流感染。5血流感染 医院获得性血流感染 原发血流感染 实验室证实血流感染（Laboratory-confirmed Bloodstream Infection, LCBI） 临床血流感染（Clinical Sepsis） 继发血流感染：血培

3、养分离出有意义微生物，而且此微生物与另一部位之院内感染有关。唯不包括血管或血管内导管装置所引起之血流感染。 社区获得性血流感染6实验室证实血流感染（LCBI）标准一：从一次或多次血标本中培养出一种一致的致病菌，而且培养出的病原体与其它部位的感染无关。标准二：病人至少具有下列症状和体征之一：发热（38 C ），寒颤或低血压，并致病符合下列之一： 1.从两次或两次以上不同部位抽血的标本中培养出皮肤寄生菌（如类白喉杆菌、芽孢杆菌、丙酸杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌或微球菌）。 2.至少一次从带血管内导管的病人血标本中培养出皮肤寄生菌群（如类白喉杆菌、芽孢杆菌、丙酸杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌或微球菌），并且主

4、管医生开始了适当的抗菌药物治疗。 3.血中抗原检测阳性（如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌或B群链球菌）。与实验室阳性结果一致的症状和体征与其它部位的感染无关。标准三：年龄38 C ），低温（37 C ），呼吸暂停、脉搏徐缓，并具有下列之一（同上3点略）7临床血流感染（Clinical Sepsis）具有下列二条件之一者：具有非其它已知原因所引起的发烧、血压过低（收缩压90mmHg或收缩压低于平常超过40mmHg），少尿（每小时尿量低于30ml）等临床症状任何一项，且符合下列所有条件者： 未做血培养，或血培养阴性或血液抗原反应呈阴性者 其它部位无明显感染者 医生针对此感染中毒症状给予适当

5、抗菌药物治疗1岁以下婴儿 ，具有非其它书籍原因引起的发烧、体温过低、呼吸中止或心跳过缓等临床症状任何一项，且符合下列所有条件者： 未做血培养，或血培养阴性或血液抗原反应呈阴性者 其它部位无明显感染者 医生针对此感染中毒症状给予适当抗菌药物治疗8BSI流行病学特点 BSI发病率逐年增加 凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌、真菌血流感染发病率逐年上升，革兰阴性菌下降 耐药菌比例逐年增加 社区获得与医院获得血流感染病原谱存在差异 院内BSI患者病死率高9美国脓毒血症流行病学+600%+300%+300%Martin et al, NEJM 2003;348:154610加拿大CANWORD监测2002-20

6、09Diag Microbiolo Infect Dis. 2011; 69: 30711加拿大CANWORD监测2002-2009Diag Microbiolo Infect Dis. 2011; 69: 30712美国49医院BSI病原谱CID. 2004, 39: 309-31713PUMCH2012年834血培养分离株14PUMCH2012年144株BSI大肠埃希菌药敏结果ESBL 60.2%15PUMCH2012年67株BSI肺炎克雷伯菌药敏结果ESBL 34.4%16PUMCH2012年61株BSI鲍曼不动杆菌药敏结果17PUMCH2012年76株BSI金黄色葡萄球菌药敏结果18P

7、UMCH2012年46株BSI草绿色溶血链球菌药敏结果192011CHIF-NET489株BSI酵母菌202011CHIF-NET念珠菌对氟康唑的敏感性212011CHIF-NET念珠菌对伏立康唑的敏感性222011CHIF-NET其他酵母菌对氟康唑的敏感性232011CHIF-NET其他酵母菌对伏立康唑的敏感性24采血量是影响血培养阳性率的独立相关因素 CLSI M47-A：每位患者采集23套血培养（4060ml） Surviving Sepsis Campaign Guidelines (Worldwide)：抗菌药物治疗前至少采集2套血培养 英国NHS血培养标准：采集2套血培养25采血量

8、对血培养阳性率的影响JCM 200726采血量对血培养阳性率的影响J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):404727J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047 Routine Set Mayo Clinic:2 BACTEC Aerobic Plus Bottles + 1 BACTEC Anaerobic Lytic Bottle采血量和阳性率非条件致病菌28 在多次血培养中单次培养下列细菌阳性 凝固酶阴性葡萄球菌 棒状杆菌 微球菌 丙酸杆菌 芽孢杆菌 如多次培养阳性，可能为条件致病菌，需结合临床分析血培养污染菌29非条件致病菌Ma

9、yo Clinic(p38C or 90/min; 呼吸 20/min; 白细胞12 or 10% 未成熟中性粒细胞 32%患者有1瓶以上CNS阳性，BSI68 %，污染12% (p 0.001) 没有SIRS症状：BSI 5%，污染29% (p 30秒1%2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒：从穿刺点向外画圈消毒,直径3cm70%酒精脱碘 一步法葡萄糖酸洗必泰作用30 s，或70%异丙醇消毒后自然干燥，但不适用于2个月以内的新生儿。38急诊血培养污染率与工作量相关 The University of Michigan Health System急诊 血培养大多数由采血员采集，其次为护士和医生

10、 采血员:病人= 1:9，重症区护士:病人= 2:3，其它区域护士:病人=1:4 年病人量82521人，采集血培养者7586人 11.4%至少1瓶阳性，病原菌阳性率8.0%，污染率3.7% 多套培养患者阳性率7.4%，单套培养阳性率5.1%（p0.001），污染率无显著差别（2.2% vs. 2.6%）Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online39急诊小时工作量Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online40繁忙时血培养污染率增加OR=1.23OR=0.93Schuyler Halverson, et al.

11、 JCM. 2013 online41抗菌药物治疗与血流感染死亡率死亡率Chest 115 (2): 199942血培养三级报告制度血培养血培养阳性阳性终报告终报告革兰染色革兰染色传种培养传种培养初步报告初步报告 (直接药敏直接药敏)鉴定菌株鉴定菌株电话报告电话报告鉴定标准药敏鉴定标准药敏43血培养结果回报对治疗的影响 A = Appropriate Therapy(正确治疗) I = Inappropriate Therapy(不正确治疗)Clin Infec Dis 24:584-602, 199744血流感染快速分子诊断 分子诊断不受抗菌药物使用的影响 血培养阳性后分子诊断 直接使用血标

12、本进行分子诊断 快速 但不能提供药敏结果45血培养阳性瓶分子鉴定Antigone Kotsaki, et al. Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):20946阳性血培养基于PCR的检测 PCR特异性检测 病原特异性PCR 特定耐药基因检测：葡萄球菌mecA, 肠球菌van 细菌载量：肺炎链球菌自溶毒A基因lytA拷贝数 广谱检测：PCR扩增特定靶位 多态性分析 测序 后续基因检测 种特异性real-time PCRExpert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209. Curr Opin Infect Dis. 2011, 24(

13、2):13747qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌 Target：ecfX gene 血培养系统：BacT/ALERT，87瓶FA、13瓶FN，涂片均显示G-b 对照方法：氧化酶，API 20E DNA提取：0.5ml肉汤，离心后加裂解液，水煮法 定量PCR： 扩增：Oligonucleotide primers 基因特异性检测：fluorescent-labeled hybridization probes，152bp fragmentAnnal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:2148qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌 33瓶pae，敏感性和特异

14、性均为100% 1瓶kpn+pae，由于pae (20CFU/ml)kpn (108CFU/ml)，PCR(-) 检测限：将ATCC27853 ecfX基因克隆至TOP10 E.coliAnnal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:2149阳性血培养基于PCR的检测 最常见病原体多重PCR 电泳谱、ELISA杂交、多重Real-time PCR Hyplex BloodScreen (BAG, Lich, Germany): 多重PCR+ELISA, 4.5-6h完成 Prove-It Sepsis (Mobidiag, Helsinki, Finland)：

15、多重real-time PCR+微阵列分析，检测多种病原及mecA，3h完成 多重Real-time PCRExpert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209.50血培养阳性多重real-time PCRNEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 201351血培养阳性多重real-time PCRNEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 201352血培养阳性PNA FISH核酸荧光原位杂交 血培养阳性肉汤革兰染色PNA FISH革兰阴性菌：商品化试剂盒eco/kpn/paeEfa/其它肠球Sau/scnCal/cgl/其它念

16、珠菌报道Salmonella spp.90min PNA FISH完成Appl Environ Microbiol. 2010 ;76:4476 J. Clin. Microbiol. 2013, 51(4):1301J Clin Microbiol. 2009; 47: 247 53MALDI-TOF MS 基质辅助激光解析电离（MALDI） 原理：将样品分散在基质分子中形成结晶后直接进样，当用激光照射结晶时，基质吸收了激光的大部分能量，使基质分子和样品获得能量投射到气相并得到电离，成为带电荷的离子。 基质在样品离子形成过程中起到了质子化或去质子化的作用，使样品带上正电荷或负电荷，成为带电荷

17、的离子 基质会干扰被检测分子质谱峰的大小和浓度；不同类型的分析物选择不同的基质54MALDI-TOF MS 飞行时间（TOF） 原理：离子源产生的离子在加速电场获得动能，当进入高真空无电场飞行管道并在此管道内飞行时，质量较轻的离子飞行速度快，早到达检测器；质量较重的离子飞行速度慢，晚到达检测器。因此依据离子的飞行时间与其质荷比平方根（m/z）成正比的关系，通过测定飞行时间，计算出相应离子的分子量。55MALDI-TOF MS操作步骤56MALDI-TOF MS快速鉴定阳性血培养 使用菌落、阳性血培养肉汤鉴定 快速：20分钟(从报警到鉴定出结果）MALDI-TOF MS(Bruker)+BACT

18、EC(BD): 正确鉴定：193/213阴性菌（包括厌氧菌）(90.61%)，284/319阳性菌(89.02%) 80.9%复数菌正确鉴定出一种，7株缓症链球菌鉴定为spnMALDI-TOF MS(Bruker)+BacT/ALERT(bioMrieux): 388个阳性瓶，种正确率91%（包括念珠、厌氧菌） 15瓶复数菌：使用通用库多鉴定出一种，革兰染色后使用阴性或阳性库分析，6瓶鉴定出第二种菌Clin Microbiol Infect 2010; 16: 1631J Clin Microbiol 2010; 48: 154257MALDI-TOF MS VITEK MS(bioMrieu

19、x) 以16s为金标准，980株临床分离株，ID正确率 肠杆菌科97.7% 非发酵菌92% 葡萄球菌属94.3% 链球菌属84.8% HACEK84% 酵母菌85.2%J Clin Microbiol. 2010; 48: 90058PCR/ESI MS 广谱PCRESI MS（电喷射质谱） 189阳性血培养和45阴性血培养，种一致率98.7% 6例spn标本方法阴性 提供定量结果评估病原体载量 假阴性率24%：几乎均由混合感染导致 5-6h完成检测 结合PCR的敏感性和ESI MS特异性 可以直接检测标本，不需要培养Proc Natl Acad Sci. 2005;102:801259血标本

20、分子检测 种特异性、属特异性、广谱、多重PCR、微阵列分析 血培养阴性的苛养菌，如Bartonella spp.巴尔通体, Coxiella burnetii伯氏考克斯体, Mycoplasma spp.支原体, Chlamydia spp.衣原体, Ricketssia spp.立克次体，Tropheryma whipplei60商品化分子生物学检测方法:血标本 SeptiFast(Roche)：multiplex real-time PCR，种属特异性荧光探针，检测重要血流感染致病菌 SepsiTestTM (Molzym)：eubacterial and panfungal real-t

21、ime PCR， a 16S and 18S rRNA gene-based universal PCR+ sequencing，几乎可以鉴定所有细菌、真菌 VYOO (SIRS Lab)：multiplex PCR，检测重要血流感染菌，电泳分离扩增片段 Plex-ID (Abbott)：eubacterial and panfungal PCR+质谱，几乎可以鉴定所有细菌、真菌Intensive Care Med. 2011 May, publish online. 61SeptiFast test检测的病原谱BMJ Open 2012;2:e000392Intensive Care Med (2010) 36:495662