遗传育种学第十七章-分子育种详解课件

1、第十七章第十七章 分子育种分子育种1. 分子育种的概念与程序分子育种的概念与程序1.1 概念概念 按照人们的愿望，进行严密的设计，通按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外过体外 DNADNA重组技术重组技术 和和 DNADNA转移技术，有目转移技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在短时间内的地改造生物种性，使现有物种在短时间内趣于完善，以创造出新的生物类型的技术体趣于完善，以创造出新的生物类型的技术体系系 ，亦即基因工程。，亦即基因工程。 1.2 1.2 植物基因工程植物基因工程 植物基因工程是近植物基因工程是近2020年来随着年来随着DNADNA重组重组技术、植物遗传转化技术及植物组织培

2、养技术、植物遗传转化技术及植物组织培养技术而发展起来的现代生物技术。技术而发展起来的现代生物技术。基因工程的基本概念基因工程的基本概念转化转化（Transformation)Transformation)：是指将外源：是指将外源DNADNA导入受体细胞的过程。导入受体细胞的过程。复制子复制子（Replicon)Replicon)：具有一个复制起点：具有一个复制起点 (ori) (ori) 的的DNADNA分子称为一个复制子。分子称为一个复制子。载体载体（VectorVector）：能与外源）：能与外源DNADNA连接并实现连接并实现转化的复制子。转化的复制子。重组子重组子（Recombinan

3、tRecombinant）：连接了外源）：连接了外源DNADNA分子的复制子。分子的复制子。1.3 1.3 基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤重组子的检测重组子的检测重组子的检测重组子的检测1.4 观赏植物基因工程的目的基因观赏植物基因工程的目的基因观赏性观赏性: :开花、花色、花型、花径相关基因。开花、花色、花型、花径相关基因。抗逆性抗逆性: :抗虫、抗旱、耐盐碱、抗寒相关基因抗虫、抗旱、耐盐碱、抗寒相关基因切花寿命切花寿命花期调控花期调控2. 基本技术及原理基本技术及原理2.1 DNA重组技术重组技术 将外源将外源DNA片段与载体分子连接，形片段与载体分子连接，形成重组成重组DNA分子，

4、再将重组子导入寄主细分子，再将重组子导入寄主细胞内。这一技术体系称为胞内。这一技术体系称为DNA重组技术。重组技术。2.1.1 2.1.1 目的基因的分离（或合成）目的基因的分离（或合成） 常用的几种目的基因：常用的几种目的基因： 基因工程的工具酶基因工程的工具酶: 限制性内切酶（限制性内切酶（restriction endonuclease) DNA连接酶（连接酶（ligase) 末端修饰酶末端修饰酶2.1.2 基因工程的载体系统基因工程的载体系统质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体病毒载体病毒载体w质粒图谱及质粒构建质粒图谱及质粒构建启动子启动子 外源基因外源基因 终止子终止子 启动子启动

5、子 报告基因报告基因 终止子终止子 （标记基因）（标记基因） 目的片段目的片段 选择标记选择标记 载体载体植物基因工程的报告基因：植物基因工程的报告基因：定义定义:特点特点: 在选择培养基上生长在选择培养基上生长 报告基因与目的基因嵌和表达报告基因与目的基因嵌和表达 研究调控区研究调控区报告基因的种类报告基因的种类:新霉素磷酸转移酶（新霉素磷酸转移酶（ Neomycine Neomycine phosphotransferase II, NPT II)phosphotransferase II, NPT II)基因基因氯霉素乙酰基转移酶（氯霉素乙酰基转移酶（Chloraphenicol Chl

6、oraphenicol acetyltransferase, CATacetyltransferase, CAT）基因）基因潮霉素磷酸转移酶（潮霉素磷酸转移酶（Hygromycin Hygromycin phosphotransferase, Hptphosphotransferase, Hpt）基因）基因 葡萄糖酸苷酶葡萄糖酸苷酶 （ Glucuronidase, GUS Glucuronidase, GUS）基因）基因荧光素酶（荧光素酶（Luceferase, LucLuceferase, Luc）基因）基因抗除草剂（抗除草剂（Basta, BarBasta, Bar）基因）基因2.2.1

7、 外源外源DNADNA导入植物细胞的方法导入植物细胞的方法 载体介导的转化方法：载体介导的转化方法： 致癌农杆菌介导的致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法质粒载体转化法 病毒介导的基因转移病毒介导的基因转移 DNADNA直接导入法：直接导入法： 化学法：化学法：PEG诱导的基因转化诱导的基因转化 电激法介导电激法介导 显微注射显微注射 媒体介导法媒体介导法 脂质体介导脂质体介导 超声波介导超声波介导 基因枪介导基因枪介导致癌农杆菌介导的致癌农杆菌介导的TiTi质粒载体转化法质粒载体转化法 含有含有TiTi质粒的致癌农杆菌与一些植物的质粒的致癌农杆菌与一些植物的细胞接触后，细胞接触后，TiTi质粒

8、的一部分（质粒的一部分（T-DNAT-DNA）可以）可以导入植物细胞，整和到植物基因组导入植物细胞，整和到植物基因组DNADNA随其复随其复制。根据这一特性可构建一系列制。根据这一特性可构建一系列TiTi质粒载体，质粒载体， 与含目的片段的与含目的片段的DNADNA片段重组，导入致癌农杆片段重组，导入致癌农杆菌，再采用叶盘法、原生质体培养法、细胞菌，再采用叶盘法、原生质体培养法、细胞培养法，通过致癌农杆菌介导进入植物细胞。培养法，通过致癌农杆菌介导进入植物细胞。 TiTi质粒质粒 根瘤农杆菌染色体外的遗传物质，根瘤农杆菌染色体外的遗传物质，为共价闭合环状的为共价闭合环状的DNADNA分子。分子

9、。TiTi质粒的功能质粒的功能为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力；为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力；参与寄主细胞合成激素的能力；参与寄主细胞合成激素的能力；诱发植物产生冠瘿瘤；诱发植物产生冠瘿瘤；赋予寄主分解冠瘿碱的能力；赋予寄主分解冠瘿碱的能力；决定寄主范围。决定寄主范围。 TiTi质粒的结构质粒的结构T-DNAT-DNA区区Vir Vir 区区Con Con 区区Ori Ori 区区Vir 区区LBRBETi PlasmidT-DNAT-DNA区区Ori Ori 区区Con Con 区区Vir Vir 区操纵子的基因结构与功能区操纵子的基因结构与功能VirVir区是一段长度为区是一段长度

10、为35KB35KB操纵子操纵子包含六个基因：包含六个基因： VirAVirA、VirB VirB 、 VirC VirC 、 VirD VirD 、 VirE VirE 、 VirGVirG。核心区核心区左边界左边界右边界右边界T-DNAT-DNA的结构与功能的结构与功能LBRBLBRB植物遗传转化的载体系统植物遗传转化的载体系统一元载体（顺势载体）一元载体（顺势载体）双元载体（反式载体）双元载体（反式载体）农杆菌介导的转化质粒的构建农杆菌介导的转化质粒的构建P G2 T NOSAmpAmpr r P G1 T目的基因目的基因报告基因，选择标记基因报告基因，选择标记基因Vir区区目的基因目的基

11、因报告基因，选择标记基因报告基因，选择标记基因LBRB农杆菌导入方法 共培养法共培养法 叶盘转化法叶盘转化法 整株感染法整株感染法 原生质体共培养法原生质体共培养法基因枪介导的转基因操作：l基本原理基本原理l操作步骤操作步骤l优点优点l影响转化效率的因素影响转化效率的因素操作步骤：操作步骤：预培养预培养转基因操作转基因操作转基因植株筛选和培养转基因植株筛选和培养转基因植株的鉴定转基因植株的鉴定田间释放田间释放影响转化效率的因素：影响转化效率的因素：金属微粒金属微粒DNADNA沉淀辅助剂沉淀辅助剂DNADNA纯度和浓度纯度和浓度微弹速度微弹速度植物材料植物材料基因枪法的优点：基因枪法的优点：无宿

12、主限制；无宿主限制；靶受体类型广泛；靶受体类型广泛；可控度高；可控度高；操作简便。操作简便。问题：转化效率低；转化效率低；嵌合体多；嵌合体多；稳定性差，瞬时表达；稳定性差，瞬时表达；外源基因沉默；外源基因沉默；整合机理不详。整合机理不详。PEG诱导的基因转化 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）、多聚鸟苷酸、磷酸）、多聚鸟苷酸、磷酸钙在高钙在高PHPH值条件下诱导原生质体扑获值条件下诱导原生质体扑获DNADNA分分子。子。步骤：步骤：共保温；共保温；稀释稀释PEGPEG；非选择培养；非选择培养；选择培养。选择培养。优点：优点：转化顺利，对细胞伤害小；转化顺利，对细胞伤害小；避免嵌合体的生成；避免

13、嵌合体的生成；易于选择；易于选择；便于进行理论研究；便于进行理论研究；受体广泛。受体广泛。脂质体介导：脂质体介导：用化学物质将用化学物质将DNADNA包裹成球体，通包裹成球体，通过植物原生质体的吞过植物原生质体的吞噬作用，把噬作用，把DNADNA导入导入细胞。细胞。电激法介导： 利用高压脉冲利用高压脉冲作用，在原生质体作用，在原生质体上形成可逆的瞬间上形成可逆的瞬间通道，从而促进外通道，从而促进外源源DNADNA的摄取。的摄取。2.2.2 转基因操作的受体系统转基因操作的受体系统高频再生体系的建立：高频再生体系的建立： 愈伤组织再生系统愈伤组织再生系统 直接分化再生系统直接分化再生系统 原生质

14、体再生系统原生质体再生系统 胚状体再生系统胚状体再生系统 生殖细胞再生系统生殖细胞再生系统抗生素敏感实验：抗生素敏感实验： 抑制细菌生长抑制细菌生长 杀死非转化细胞杀死非转化细胞农杆菌敏感实验：农杆菌敏感实验：2.3 转化细胞的培养和转基因植株的再生 恢复生长 筛选培养 植株再生2.4 转基因植物的鉴定转基因植物的鉴定 遗传鉴定遗传鉴定 表达鉴定表达鉴定 表型分析鉴定表型分析鉴定利用报告基因利用报告基因Northern Northern 杂交杂交Western Western 杂交杂交 直接鉴定直接鉴定DNADNA分子是否整合分子是否整合到基因组上。到基因组上。1 1）扩增目的片段；）扩增目的

15、片段；2 2）杂交信号鉴定。）杂交信号鉴定。（Southern 杂交杂交）鉴定步骤：鉴定步骤：l筛选鉴定（利用质粒上的选择标记）筛选鉴定（利用质粒上的选择标记）l报告基因鉴定（利用质粒上的报告基因）报告基因鉴定（利用质粒上的报告基因）l遗传鉴定遗传鉴定l生长试验生长试验 DNA鉴定鉴定- southern RNA鉴定鉴定- northern蛋白质鉴定蛋白质鉴定- western适宜外植体的选择及再生体系的建立适宜外植体的选择及再生体系的建立抗生素筛选压的确定及农杆菌菌株的选择抗生素筛选压的确定及农杆菌菌株的选择遗传转化操作遗传转化操作l 载体介导的载体介导的 转化方法转化方法l DNA直接导入

16、法直接导入法l 种质系统法种质系统法选择培养选择培养转基因植株鉴定转基因植株鉴定获得再生植株获得再生植株转化质粒的构建转化质粒的构建转基因植株的繁殖与应用转基因植株的繁殖与应用利用报告基因利用报告基因Southern 杂交杂交Northern 杂交杂交Western 杂交杂交3. 基因工程的安全性基因工程的安全性安全问题的考虑：安全问题的考虑：工程菌株的处理工程菌株的处理转基因植物的释放转基因植物的释放转基因产品的安全转基因产品的安全转基因作物本身成为杂草；转基因作物本身成为杂草；转基因作物使其亲缘野生种成为杂草或超级杂草；转基因作物使其亲缘野生种成为杂草或超级杂草；转基因作物可能产生新的病毒

17、或疾病；转基因作物可能产生新的病毒或疾病；转基因作物对非目标生物的危险；转基因作物对非目标生物的危险；转基因作物作为外来种对新生境的入侵，使生物多转基因作物作为外来种对新生境的入侵，使生物多样性受到威胁；样性受到威胁；转基因作物对生态系统及生态过程的影响：转基因作物对生态系统及生态过程的影响：其它一些不可预计的风险。其它一些不可预计的风险。 转基因植物的风险：转基因植物的风险：生物安全的管理：生物安全的管理：法国为对遗传修饰生物体法国为对遗传修饰生物体(GMO)(GMO)的评价和的评价和立法成立了两个专门委员会。立法成立了两个专门委员会。u第一个是遗传工程委员会，成立于第一个是遗传工程委员会，

18、成立于19751975年，任务集中于实验室的重组年，任务集中于实验室的重组DNADNA的研究的研究u19861986年又成立了生物分子工程委员会，年又成立了生物分子工程委员会，它的任务是评价遗传修饰生物体的大田试验、它的任务是评价遗传修饰生物体的大田试验、释放以及商品化过程的安全问题。释放以及商品化过程的安全问题。 进入进入9090年代特别是年代特别是19921992年联合国环境年联合国环境与发展大会的召开，更加促进了国际上对与发展大会的召开，更加促进了国际上对生物安全立法工作的重视，特别是大会由生物安全立法工作的重视，特别是大会由许多国家签署的两个纲领性文件许多国家签署的两个纲领性文件2121世纪世纪议程议程和和生物多样性公约生物多样性公约均在有关条均在有关条款中提到了生物技术安全问题。款中提到了生物技术安全问题。 19931993年，在原国家科学技术委员会领年，在原国家科学技术委员会领导下成立了国家生物遗传工程安全委员会，导下成立了国家