实验四植物叶绿素的定量与分光光度计的使用

1、植物叶绿素的定量测定及吸收光谱 分光光度计的使用2010.04.07一、实验目的一、实验目的 l学习基本的物质定量测定方法与学习基本的物质定量测定方法与分光光度计的使用。分光光度计的使用。l学习测定叶绿素总量及吸收光谱学习测定叶绿素总量及吸收光谱的技术的技术二、实验原理二、实验原理l叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要有：叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要有： 1、原子吸收光谱法：、原子吸收光谱法： 2、分光光度法：、分光光度法：l 叶绿素叶绿素a 和叶绿素和叶绿素b 在在649nm 和和665nm 处处有最大吸收，且两吸收曲线相交于有最大吸收，且两吸收曲线相交于652nm 处。处。因此测定

2、提取液在因此测定提取液在649nm、665nm，并根据，并根据经验公式可分别计算出叶绿素经验公式可分别计算出叶绿素a、叶绿素、叶绿素b和和总叶绿素的含量。总叶绿素的含量。 三、仪器、原料和试剂三、仪器、原料和试剂 l分光光度计、天平、研钵、棕色容量瓶、分光光度计、天平、研钵、棕色容量瓶、小漏斗、定量滤纸、新鲜的植物叶片、小漏斗、定量滤纸、新鲜的植物叶片、95乙醇乙醇(或或80丙酮丙酮)、石英砂、碳酸、石英砂、碳酸钙粉钙粉四、操作步骤四、操作步骤 1.叶绿素滤液的提取制备：叶绿素滤液的提取制备：2.比色与结果计算：比色与结果计算：3.吸收光谱曲线测定与绘制吸收光谱曲线测定与绘制1.叶绿素滤液的提

3、取制备：叶绿素滤液的提取制备：l叶片叶片0.5g、石英砂和碳酸钙粉、石英砂和碳酸钙粉、3mL95乙醇，研磨之糊状；再加乙醇乙醇，研磨之糊状；再加乙醇10mL ，研，研磨至组织变白磨至组织变白 。l静置静置35min 。l用滤纸过滤至棕色容量瓶中，少量乙醇冲用滤纸过滤至棕色容量瓶中，少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次洗研钵、研棒及残渣数次 。l定容至定容至25mL。2.比色与结果计算：比色与结果计算：l以以95乙醇为空白对照，在波长乙醇为空白对照，在波长665nm、649nm 和和652nm 下测定滤液的吸光度。下测定滤液的吸光度。l95 乙醇提取液中色素浓度计算公式乙醇提取液中色素浓度计算公式（

4、mg/L）：）： Ca=13.95A665-6.88A649 Cb=24.96A649-7.32A665 叶片色素的含量叶片色素的含量 五、在五、在96乙醇中叶绿素的吸收光谱乙醇中叶绿素的吸收光谱 l95乙醇作空白对照，在乙醇作空白对照，在400-700nm范围内以范围内以20nm间隔测定并记录提取间隔测定并记录提取液的光密度读数，在最大吸收部位，液的光密度读数，在最大吸收部位，以以5毫微米为间隔增加读数。毫微米为间隔增加读数。l以光密度读数为纵坐标，波长为横坐以光密度读数为纵坐标，波长为横坐标，绘叶绿素吸收光谱图。标，绘叶绿素吸收光谱图。 叶绿素吸收光谱曲线 721型分光光度计的工作原理型分

5、光光度计的工作原理 l分光光度计的基本工作原理分光光度计的基本工作原理 l721型分光光度计的构造型分光光度计的构造 l721型分光光度计的使用方法型分光光度计的使用方法l721型分光光度计使用和维护中应型分光光度计使用和维护中应注意事项注意事项基本工作原理基本工作原理l物质对光物质对光(对光的波长对光的波长)的吸收具有选择性，不同的的吸收具有选择性，不同的物质都有各自的吸收光带。当光色散后的光谱通过物质都有各自的吸收光带。当光色散后的光谱通过某一溶液时，其中某些光线就会被溶液吸收。某一溶液时，其中某些光线就会被溶液吸收。 l吸光度吸光度:是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强是指光线通过溶液

6、或某一物质前的入射光强度度 与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数。对数。 l吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关。吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关。只要光的波长被固定下来，同一种物质，吸光系数只要光的波长被固定下来，同一种物质，吸光系数就不变。就不变。 l比尔定律比尔定律 ：在一定的波长下，溶液中物质的浓度与：在一定的波长下，溶液中物质的浓度与光能量减弱的程度有一定的比例关系光能量减弱的程度有一定的比例关系 。A=lg(1/T)=Kbc。 721型分光光度计的构造型分光光度计的构造 l721型分光光度计允许的测定波长范围在

7、型分光光度计允许的测定波长范围在360800nm。 721型分光光度计的使用方法型分光光度计的使用方法l预热预热 灵敏度选灵敏度选 择波长选择择波长选择 T调调“0” T调调“100%” 测定、读数测定、读数 完毕完毕l预热：打电源开关，掀开暗箱盖，预预热：打电源开关，掀开暗箱盖，预热热10-20min。 l灵敏度选择：将灵敏度开关调至灵敏度选择：将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器调不到档（若零点调节器调不到“0”时，需时，需选用较高档。）选用较高档。） l波长选择：根据所需波长转动波长选波长选择：根据所需波长转动波长选择钮。择钮。 lT调调“0”：在暗箱盖开启状态下调节：在暗箱盖开启状态

8、下调节零点调节器，使读数盘指针指向零点调节器，使读数盘指针指向T=0处。处。l将空白液及测定液分别倒入比色杯将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。内，使空白管对准光路。 lT调调“100%”：盖上暗箱盖，调节：盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白管的调节器，使空白管的T=100。l测定：指针稳定后，逐步拉出样品滑测定：指针稳定后，逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。记录。 l比色完毕：关上电源，取出比色皿洗比色完毕：关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。净，样品室用软布或软纸擦净。使用和维护中应注意事项使用和维护中应注意事项 l连续使用不应超过连续使用不应超过2小时，最好是间歇小时，最好是间歇0.5小时后，再继续使用。小时后，再继