器官移植配型

1、 器官移植配型理论与技术基本概念基本概念n广义的器官移植：用自身或异体的正常器官、组织或细胞置换病变或功能缺失的器官、组织或细胞，以维持和重建机体的生理功能。n影响移植成功的关键因素是可能发生的免疫排斥反应；一一. . 基本概念基本概念人人人人猪猪相关概念相关概念同种异体移植异种移植同系移植移植自体移植引起排斥反应的抗原nABO血型抗原；n组织特异性抗原；n主要组织相容性抗原(MHA, major histocompatibility antigen )，又称人类白细胞抗原（HLA）;n次要组织相容性抗原（mHA, minor histocompatibility antigen ）H-Y抗原

2、;HLA的基因结构、抗原结构及特点n由第6号染色体短臂21.31区编码，按功能分为HLA-I,三个区域，其中I,区编码抗原与移植关系密切。HLA-I类抗原主要由A、B、C位点编码；HLA-类抗原由DR、DP、DQ位点编码；nHLA-I类抗原是由第6号染色体相应I类基因编码的链与第15号染色体编码的2微球蛋白非共价键结合的糖蛋白，主要表达在有核细胞表面；nHLA-类抗原由第6号染色体相应类基因编码的链和链非共价键结合的糖蛋白，主要表达在抗原递呈细胞，胸腺上皮细胞表面；HLA抗原的生物学功能n1.参与蛋白质抗原的处理与递呈；n2.调节免疫应答；n3.参与T细胞分化过程；n4.介导同种免疫应答；HL

3、A基因的遗传特点n1.高度多态性；HLA基因呈现多位点复等位的特点；n2.共显性遗传：每对等位基因同时表达；n3.单倍型遗传：位于同一条染色体上的 HLA各位点的基因组合；n4.连锁不平衡：单倍型基因非随机分布的现象；2.传统的HLA分型技术n血清学分型:补体依赖的细胞毒实验;n待测淋巴细胞与已知抗体孵育，再加入补体，若该抗体与淋巴细胞膜上HLA分子相匹配，则激活补体系统导致待测细胞膜的破坏，否则细胞膜完整不受影响。n局限性：需要活的淋巴细胞；存在交叉反应；隐蔽抗原无法识别；人为影响因素多质控难做；n细胞学分型：混合淋巴细胞培养技术；n受者淋巴细胞与已知类型的淋巴细胞或者供者淋巴细胞混合培养，

4、两种细胞HLA分子表型如果相同则不能刺激淋巴细胞增殖，反之则刺激淋巴细胞增殖，分为单双向两种类型。n局限性：需要活的纯合子表型的淋巴细胞；增殖检测方法要用到同位素；分子生物学技术分型nHLA抗原蛋白分子的多态性取决于相应编码基因的多态性；nRFLP/PCR-RFLP/PCR-SSP;nPCR-SSCP;nPCR-Sequencing；nPCR-SSO/基因芯片技术；n流式细胞仪技术；n氨基酸残基配型标准分析技术；聚合酶链反应聚合酶链反应（PCR） 在多聚合酶，在多聚合酶，引物，底物和模引物，底物和模板的参与下通过板的参与下通过变性，退火，延变性，退火，延伸三个循环步骤伸三个循环步骤在短时间内达

5、到在短时间内达到对目的片断的大对目的片断的大量扩增，是基因量扩增，是基因分型的基础。分型的基础。RFLP/PCR-RFLP/PCR-SSP/基因组基因组DNA 提取提取 酶切酶切 电泳分析电泳分析（RFLP） DNA 扩增（共性引物扩增（共性引物/特异性引物）特异性引物） (限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切) 电泳检测电泳检测(PCR-RFLP/PCR-SSP) PCR-SSCP（单链构象多态性）n提取基因组提取基因组DNA PCR扩增（特异引物）扩增（特异引物） 变性变性(双双链链 单链单链) 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 根据带型根据带型可检出基因的多态性又可检出点突变，有利于发现

6、新可检出基因的多态性又可检出点突变，有利于发现新的等位基因的等位基因PCR-sequencingn提取基因组提取基因组DNA PCR扩增（非特异扩增（非特异/特异引物）特异引物）DNA测序测序n最可靠、直接、准确的最可靠、直接、准确的HLA分型方法；分型方法；n临床上应用限制了供体的来源；临床上应用限制了供体的来源；n在确定等位基因的多态性、发现新位点、基因定位等在确定等位基因的多态性、发现新位点、基因定位等研究领域应用较多；研究领域应用较多；PCR-SSO（序列特异性寡核苷酸探针杂交）/基因芯片技术n正向杂交：正向杂交：提取基因组提取基因组DNA PCR扩增（共性引物）扩增（共性引物） 将将

7、PCR产物固定在固相支持载体上并进行变性处理产物固定在固相支持载体上并进行变性处理 与标记的特异性与标记的特异性寡核苷酸探针变性杂交寡核苷酸探针变性杂交 根据杂交信号判断根据杂交信号判断HLA类型；类型；n反向杂交：反向杂交：将特异性寡核苷酸探针固定在固相载体上将特异性寡核苷酸探针固定在固相载体上 与标记与标记的的PCR产物（已经变性处理）杂交产物（已经变性处理）杂交 根据杂交信号判断根据杂交信号判断HLA类类型；型；n基因芯片技术是一种反向基因芯片技术是一种反向PCR-SSO方法，具有高通量、缩微化、方法，具有高通量、缩微化、自动化程度高、准确性高等优势；自动化程度高、准确性高等优势；流式细

8、胞仪技术n提取基因组提取基因组DNA 非特异性非特异性PCR扩增扩增 变性处理变性处理 与包被了特异性与包被了特异性HLA探针的微球结合探针的微球结合 洗脱处理洗脱处理 通过流式细胞仪检测通过流式细胞仪检测n利用流式细胞仪技术将反向的固相利用流式细胞仪技术将反向的固相PCRSSO技术变技术变为液相检测分析技术；为液相检测分析技术；n每种包被了不同类型每种包被了不同类型HLADNA探针的微球对应一种探针的微球对应一种荧光染色能够被流式细胞仪识别；荧光染色能够被流式细胞仪识别；n具有高通量、准确快速的优势；具有高通量、准确快速的优势；氨基酸残基配型标准分型技术n根据HLA分子346个氨基酸残基中对

9、移植物排斥与存活率具有重要影响的关键氨基酸，当供受者的关键氨基酸残基相同，尽管接受HLA抗原部分错配的供体，产生的免疫反应性仍然是低反应性或无免疫反应性，从而使移植物得以长期存活。HLA分型技术临床应用评价n1.在器官移植中具有重要临床意义； 六位点配型原则：HLA-A/B/DRn2.合理选择HLA基因分型技术； 各种方法相互补充，难以相互替代，根 据不同需求选择不同方法方方法法血清学分型血清学分型/ /细细胞分型胞分型基因分型基因分型(SSP/SSOP/SB)(SSP/SSOP/SB)识识别别位位点点HLAHLA分子抗原特分子抗原特异性，某些氨基异性，某些氨基酸残基位点酸残基位点DNADNA

10、序列差异序列差异分分辨辨率率低（抗原特异性）低（抗原特异性）HLA-A01HLA-A01低（抗原特异性）低（抗原特异性）/ /中等（集团特中等（集团特异性）异性）/ /高（等位基因特异性）高（等位基因特异性）HLA-AHLA-A* *0101；HLA-AHLA-A* *0101/0102/01030101/0102/0103； HLA-AHLA-A* *0101020301010203抗原法抗原法/ /基因法基因法1.1.字母字母HLAHLA代表染色体上一段特代表染色体上一段特殊的遗传区域（人类白细胞殊的遗传区域（人类白细胞表面抗原区域）；表面抗原区域）；2.2.A/B/DRA/B/DR代表该区域某一具体代表该区域某一具体的基因座位；的基因座位；3.3.数字代表该基因座位编码的数字代表该基因座位编码的特异性抗原（血