乙型肝炎病毒耐药基因及分型检测

1、乙型肝炎现状如何？乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（hepatitisBvirus,HBV）感染引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病，主要存在于肝细胞内，可引起肝细胞炎症、坏死和纤维化。乙型肝炎病毒（HBV 憾染呈世界性分布，全球约有 3.6 亿感染者，每年约有 100 万人死于与 HBV 相关的肝脏疾病。我国属于感染的高发区，现有的慢性 HBV 感染者约 9300 万例。乙型肝炎病毒（HBV）基因分型的临床意义HBV 根据 DNA 差异可分为 A、B、CD、E、F、GH 八种类型，不同型别在流行特征，致病性，对药物治疗反应等方面存在差异，其中，我国以 B 型和 C 型为主，感染

2、 HBV 基因型 B 的患者发生肝纤维化及肝细胞癌的平均年龄要比感染 HBV 基因型 C 的患者的年龄大。通过分型检测，可判断病毒复制活跃程度及突变发生率情况。研究表明，与 HBV-B 型相比，C 型复制较活跃，不易发生 HBeAg 血清转换；HBV-B 型易产生前 C 区突变，C 型核心启动子区变异发生率更高，与重型肝炎发病机制密切相关，可作为肝癌高危指标之一。同时，HBV-RC 型患者易产生拉米夫定耐药突变，通过分型检测，可指导临床治疗方案制定，有针对性进行临床治疗，更大程度上提高患者的生活质量。乙肝的治疗方式有哪些？HBV 感染主要的治疗方法是抗病毒治疗，国内外普遍使用的药物有干扰素和核

3、甘（酸）类。由于干扰素需要反复注射，且副作用较多，近年来，核昔（酸）类似物（NA）已成为抗 HBV 感染的主要方法之一，NA 因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者，是长期治疗的合理选择。但随着治疗时间的延长，往往会出现病毒耐药株，从而需要监测乙型肝炎病毒耐药基因型，指导临床用药。乙肝病毒产生耐药的机理是什么？HBV 对某种药物的耐药性一般是指由 HBV 基因组上某些位点的变异导致这种药物对 HBV 的抑制作用减弱或无作用。通常分为以下几种：（1）原发性耐药变异：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异，导致变异病毒株对治疗药物的敏感度下降；（2）继

4、发性耐药变异（又称补偿性耐药变异）：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降，在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异，这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感度的进一步下降；（3）基因型耐药：指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的 HBV 变异；（4）表型耐药：通过体外复制系统证实检测到的 HBV 变异会降低其对抗病毒药物的敏感度。HBV 属于嗜肝 DNA 病毒科，基因组长约 3.2kb,是部分双链环状 DNA 结构。HBV 基因组含有 4 个部分重叠的开放读框（openreadingframe,ORF）,分别为 S 基因区、C 基因区

5、、P 基因区和 x 基因区。产物为含末端蛋白、间隔区、逆转录酶区和 RNA 酶 H 区 4 部分的 HBV 聚合酶。HBV 虽然属于 DNA 病毒，但其复制过程并非 DNADNA 的直接复制过程，而是经过前基因组 RNA 的中间过程，即 DNARNADNA 的复制过程。在前基因组 RNA 逆转录为负链 DNA 的过程中，HBV 逆转录酶由于缺乏严格的校正机制，导致 HBV 复制过程中核音酸错配率较高，发生变异的频率为每年（1.43.2）X105 核昔酸替换/位点。HBV 复制的这种过程和特点，决定了同一患者体内不同的 HBV 株基因序列之间也存在差别。核甘（酸）类药物主要通过抑制 HBV 聚合

6、酶的逆转录酶区活性，阻止 HBV 复制过程中以 HBV 的前基因组 RNA 为模板逆转录生成新的病毒 DNA,从而发挥抑制病毒复制的作用,的 cccDNA 为模板合成的，即 NA 的药效靶点在 cccDNA 的下游，所以 NA 不能直接清除已经存在的 cccDNA。为了持HBV 前基因组 RNA 是以 HBV续抑制 HBV 的复制，NA 抗 HBV 治疗的疗程往往需要数年。但在长期应用某一抗病毒药物的情况下，产生选择压力，野生株被抑制。生存下来的突变株占主导，此种药物便失去了疗效，从而导致耐药的发生。HBV 对 NA 的耐药分析1 .拉米夫定(LAM)LAM 属于 L-构型核音，是目前用于临床

7、最广、时间最长的药物，其产生的耐药也是最多的。在 LAM初次治疗时，1、2、3、4 和 5 年 YMDD 突变的发生率约为 23%、46%、55%、65%和 7l%。LAM 主要的耐药突变位点是 rtM204V/I(YMDD 变异)，rtM204V 变异通常与其补偿突变 rtL180M 联合出现，rtM204V/I 株较野生株复制能力低，而rtL180M的出现使突变株HBV的复制接近野生株的水平圈。 目前报道发现的与LAM相关的主要耐药突变有rtM204V、rtM204I 和 rtL180M,其他的突变位点有 rtL80V/I、rt1169T、rtV173L、rtTI84S 和 rtQ215S

8、 这些突变通常以下面不同的组合方式出：(1)trM204I/V+rtIJ80M;(2)rtM204I:(3)rtM204V+rtL1810M+rtV173L;(4)rtM204I+rtI80I(5)rtM204I/V4+rtQ215SrtL180M(6)rtM204V+rtL180M+rtV173L+rtl169T;(7)rtA181T(8)rtM204I/V+rtT184SrtL180M(9)rtM204S+rtLl80M。这些 HBV 耐药突变株常以准种的形式存在，当使用 LAM 治疗后，突变株便可成为主要病毒侏。LAM 耐药的分子机制目前推断可能是 rtM204 位点参与形成了 LAM

9、与聚合酶的结合部位，rtM204 位点发生突变后主要产生了两方面影响：(1)使 dNTP 结合位点甲基化，从而产生空间位阻降低了 LAM 与 dNTP 底物的亲和力；(2)降低使 LAM 三磷酸根结合到正在复制的病毒 DNA 的催化活性，这些原导因致 rtM204 位点突变株的复制力减低，且与LAM 的结合力低于野生侏，从而降低了 LAM 的抗病毒作用。2 .恩曲他滨(FT。FTC 属低耐药基因屏障药物，在临床应用中应密切关注其耐药情况。体内与体外研究均表明 FTC 耐药位点与 LAM 相同，即 rtM204V/I 土 rtL180M 变异，FTC 治疗 1 年的基因型耐药发生率为 13%16

10、%,但缺乏长期的耐药数据。在开始 FTC 治疗前应充分评估患者的治疗指征，详细了解患者既往治疗史。免疫耐受期的慢性乙型肝炎(chronichepatitisB,CHB)患者除非需接受免疫抑制剂治疗等特殊情况，一般不建议进行抗病毒治疗。首次出现 ALT 升高的 CHB 患者，应分析其可能的诱因，慎重开始抗病毒治疗。FTC 治疗期间应督促患者规范服药、定期随访，尽可能提高患者依从性。如随访发现患者病毒学应答不佳或出现病毒学突破，应及时明确患者是否存在依从性问题。排除依从性问题后，应及时进行 HBV 基因型耐药检测以明确 FTC耐药情况，相应调整治疗方案。目前对于 FTC 耐药挽救治疗证据尚不充分。

11、参照 LAM 耐药挽救治疗情况，可考虑加用 ADV 或 TDF抗病毒治疗，亦可考虑换用 TDF 抗病毒治疗。3 .阿德福韦酯(ADV)ADV 属于无环嗯吟类核昔酸类似物。与 LAM 相比，在使用 ADV 初次治疗时，15 年基因耐药变异的概率分别为 0%、3%、6%、18%、29%,耐药发生的时间和机率都远低于 LAM。然而，在已产生了LAM 耐药的患者中，单独改用 ADV 治疗 1 年和 2 年，基因耐药变异率分别升高为 6.4%和 25.4%,ADV 联合 LAM 治疗可降低耐药突变发生率，对于产生 LAM 耐药的患者，加用 ADV 为首选。与 LAM 单点突变不同，ADV 相关的耐药突变

12、多为多点突变，目前得到学界公认的主要耐药位点有 rtA181T、rtA181V 和 rtN236T,组合方式主要有四种：(1)rtA181V;(2)rtN236T;(3)rtAl81V+rtN236T;rtA181T+rtN236T。 另外rtA181T突变也在长期使用LAM患者的HBV基因中检测到， 但是， 该突变并未合并rtM204I/V的突变。 有认为这是因为 rtA181V/T 突变能改变 rtM204 密码子的位置， 导致一个间接的催化位点空间位阻， 从而使 LAM的敏感性下降。有进一步研究表明 A181V/T 突变株对 LAM、LdT 和ETV 的敏感性都下降，但对 TDF 仍然敏

13、感。4 .恩替卡韦(ETV)ETV 是一种脱氧嗯吟核昔酸类似物，ETV 对初治患者很少发生耐药，1-5 年的累积耐药发生率分别为 0.2%、0.5%、1.2%、1.2%与 1.2%。但对原有 LAM 耐药的患者，改用 ETV,治疗 1-5 年后的临床耐药率分别为 6%7%、15%16%、36%、46%和 51%。因此，ETV 在 LAM 失效患者中的耐药发生率明显增加，产生 LAM 耐药的患者不推荐首选ETVo这是因为ETV的耐药变异需要在rtM204+rtL180位突变的基础上， 再联合rtT184、 rtS202、 rtM250和 rtI169 位点上一个或多个的氨基酸突变。其耐药变异主要

14、有两种模式：(1)rtM250v+rtIl69T+M204v+L180M;(2)rtT184G+rtS202I+rtM204V+rtL180M。有体外试验证实，rtM250 位点突变可引起 ETV 的敏感性下降，单独 rtI169 位点的突变对 ETV 只低度耐药，但 rtI169 联合 rtM250 位点突变则可阻止 DNA 链延伸，从而降低 ETV 敏感性；rtT184 和rtS202 位点的突变可以改变 YMDD 附近的核昔酸聚合酶结合袋的几何构像，影响 C 区的两个催化性天门冬氨酸残基的编码，从而导致对药物的敏感性下降。ETV 需多个位点的突变才能出现耐药，表明它的高基因屏障。由于 E

15、TV 抗病毒治疗的有效性及低耐药性，被推荐为乙肝肝硬化失代偿期的一线用药。5 .替比夫定(LdT)LdT 与 LAM 同属于 L-构型核音，与 LAM 耐药基序相似，都发生在 YMDD 区，但其耐药发生率低于LAM,对初治患者的第 l 与第 2 年累积耐药发生率分别为 4%与 22%。而且 LdT 出现的耐药突变位点仅有 rtM204I,尚未发现 rtM204V 变异。原因尚不清楚，有研究认为可能与其抗病毒复制的高效能有关。也有文献报道 LdT 相关的耐药突变还可发生在 rtL80、rtL180、rtL181、rtL229 等位点，其意义还有待进一步明确。6 .替诺福韦(TDF)TDF 是一种

16、新型核甘酸类逆转录酶抑制剂，国外已批准该药用于治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)和成人的慢性乙型肝炎。在 W 期临床实验中，替诺福韦治疗 2 年以上还未被证实有基因型耐药发生，但是此临床实验在治疗 72 周时对血清仍能检测到病毒者都增加使用了恩曲他滨，所以不能确定 72 周后单一使用替诺福韦治疗的耐药发生率。有报道称 rtA194T 变异与 TDF 耐药相关，能够改变 DNA 模板与 dNTP 底物的结合位点，从而影响 DNA 合成。体外实验发现，rtA181/T 或 rtN236T 突变的 ADV 耐药株对 TDF 的敏感性下降 34 倍；若此位点与 rtL180M+rtM204V 联合出现，则

17、能增加 TDF 半数抑制浓度 10 倍以上。乙型肝炎病毒耐药基因检测的临床意义(1)在初始治疗前检测，有助于判断是否感染耐药突变株，可以帮助选择初治药物；(2)在治疗过程中检测，有助于及时发现基因型耐药，从而采取预防措施，避免发生病毒反弹；(3)耐药发生后检测，可根据耐药情况及时换药加药或更改治疗方案，使患者获得更好的治疗效果。我们可以提供的乙型肝炎病毒耐药基因和分型检测项目有哪些？1.检测血液中乙肝病毒的 DNA 浓度(被称为乙肝病毒载量)。这项检测用于监测乙肝病毒在体内复制水平，从而衡量病人的受感染情况以及监测治疗情况。2.检测乙型肝炎病毒耐药基因，与六种用于乙肝抗病毒治疗的核甘(酸)类药物相关的 11个耐药位点的基因变异情况。碉L8DLI169TL8DVL183MVL73LL18DMS202IMZ04V52O2GM204T1S4GA1E1TT184S阿德福韦酯ISIVT1S4AT184IV175LT184LL18OML18OMT184F204VM250VM204IM2SJIM250L管道事.隶里A194T替就去蠹M204I3.检测乙型肝炎病毒 A、B、C、D、E、F、G、H 八种基因型。HBVHBV 耐药检测建议在使用核甘（类）药物治疗前，先做一次耐药检测，以确定用药种类在治疗的最初两年，对于轻微肝病患者，推荐每 6 个月检测一次两年后建议每 3 个月检测一次，因为这