真核细胞RNA的提取及电泳分析

1、真核细胞真核细胞RNA的提取及电泳分析的提取及电泳分析 中南大学中南大学生命科学学院生命科学学院q掌握一种真核细胞掌握一种真核细胞RNARNA的提取方法的提取方法 q熟悉熟悉RNARNA的琼脂糖凝胶电泳检测分析的琼脂糖凝胶电泳检测分析 qrRNA,8085%qtRNA,1015%，约，约5S/70-120nt qmRNA,15% ，长短不一，长短不一28S，4700 nt18S，1900 nt5.8S，160 nt5S，120 nt哺乳动物细胞总哺乳动物细胞总RNA:真核细胞真核细胞RNA分布于胞质分布于胞质75%、胞核、胞核10%、细胞器、细胞器15% qTrizolTrizol试剂是由试剂

2、是由苯酚苯酚和和异硫氰酸胍异硫氰酸胍等组成的单相、等组成的单相、快速抽提总快速抽提总RNARNA的试剂。的试剂。q十二烷基肌氨酸钠：十二烷基肌氨酸钠：破细胞膜及核膜，释放破细胞膜及核膜，释放RNARNA、DNADNA和蛋白。和蛋白。q异硫氰酸胍：异硫氰酸胍：RNaseRNase 抑制剂，抑制内源性抑制剂，抑制内源性RNaseRNase。q苯酚：苯酚：使蛋白变性。使蛋白变性。q当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，离心后形当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，离心后形 成水相层和有机相层。成水相层和有机相层。RNARNA位于水相，而位于水相，而DNADNA和蛋白和蛋白质位于分界层和有机相。质位于分界层和

3、有机相。q水相中水相中RNARNA在高盐和有机溶剂共存时沉淀分离。在高盐和有机溶剂共存时沉淀分离。 q提取的提取的RNARNA可用于可用于NorthernNorthern杂交、杂交、mRNAmRNA分离、分离、cDNAcDNA合成、合成、RT-PCRRT-PCR。qRNAisoRNAiso Blood Bloodq氯仿氯仿q异丙醇异丙醇q75%75%乙醇（乙醇（DEPCDEPC处理水配制）处理水配制）qRNaseRNase-free-free水水微量移液器微量移液器台式微量离心机台式微量离心机 电泳槽电泳槽凝胶成像系统凝胶成像系统 电泳仪电泳仪 1.取取0.25 ml血液样品移至离心管中，添加

4、血液样品移至离心管中，添加 0.75 ml RNAiso Blood。2.用移液枪上下反复吸打直至细胞完全裂解。用移液枪上下反复吸打直至细胞完全裂解。3.加入加入 0.2 ml氯仿，混匀至溶液呈乳白色。氯仿，混匀至溶液呈乳白色。4. 室温静置室温静置 5 分钟。分钟。5. 12,000g、4离心离心 15 分钟。分钟。6. 吸取上清液移至新的离心管中（切勿吸出白色中间层）。吸取上清液移至新的离心管中（切勿吸出白色中间层）。7. 向上清中加入等量体积的异丙醇，上下颠倒混匀后，室温下静置向上清中加入等量体积的异丙醇，上下颠倒混匀后，室温下静置 10 分钟。分钟。8.12,000g、4离心离心 10

5、 分钟，试管底部会出现分钟，试管底部会出现 RNA 沉淀。沉淀。9.弃上清弃上清,加入等量的加入等量的 75乙醇，振荡清洗沉淀后，乙醇，振荡清洗沉淀后，7,500g、4离心离心 5 分钟，弃上清。分钟，弃上清。10.室温干燥沉淀室温干燥沉淀23分钟，加入分钟，加入30 l RNase-free 水溶解沉淀。水溶解沉淀。11.取取5 l电泳检测，剩余电泳检测，剩余-70保存。保存。RNaseRNase（核糖核酸内切酶）生物特性十分稳（核糖核酸内切酶）生物特性十分稳定，耐热、耐酸、耐碱，作用不需辅助因子，定，耐热、耐酸、耐碱，作用不需辅助因子，存在十分广泛，本实验的关键是创造一个无存在十分广泛，本

6、实验的关键是创造一个无RNaseRNase的环境，减少的环境，减少RNARNA的降解。的降解。q去去除外源性除外源性RNase的污染，包括操作者、工作环境、的污染，包括操作者、工作环境、试剂及耗材等环节试剂及耗材等环节 戴口罩和手套，少少说话；戴口罩和手套，少少说话； 工作台面洁净，可用工作台面洁净，可用3%H2O2擦洗，空气中无灰尘；擦洗，空气中无灰尘； 离心管、离心管、Tip等塑料品用等塑料品用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液（焦碳酸二乙酯）水溶液浸泡浸泡12h，后高温高压灭菌处理；，后高温高压灭菌处理； 玻璃或陶瓷制品可玻璃或陶瓷制品可180250干烤干烤84h; RNA溶解水溶液

7、用溶解水溶液用DEPC处理过，后高温高压灭菌使用（处理过，后高温高压灭菌使用（DEPC分解成分解成CO2和和H2O）q抑制内源性抑制内源性RNase的活性的活性 细胞裂解后细胞裂解后RNase随之释放，应及时加入其抑制剂，如异硫氰随之释放，应及时加入其抑制剂，如异硫氰酸胍。酸胍。qRNase活性抑制：物理法（高温），化学法（活性抑制：物理法（高温），化学法（DEPC、VRC【氧钒核糖核苷复合物】、【氧钒核糖核苷复合物】、H2O2），生物法），生物法（RNasin）。）。q不同组织样品的预处理（如组织块、贴壁细胞）不同组织样品的预处理（如组织块、贴壁细胞）每每10 510 7细胞可提取细胞可提取

8、50100ugRNA。样品体积不要。样品体积不要超过裂解液的超过裂解液的10%。q样品保存：样品用样品保存：样品用Trizol打散后于打散后于-70可保存一个月可保存一个月以上。分离的以上。分离的RNA最好尽快反转录成最好尽快反转录成cDNA等，保存在等，保存在75%乙醇中于乙醇中于28一周，一周，-20一年。一年。 电泳后应该是有电泳后应该是有3条主带，尤其是条主带，尤其是28S和和18S两条两条带锐利清晰且亮度比约带锐利清晰且亮度比约2:1，无，无DNA杂带及向前杂带及向前拖尾现象（无降解）。拖尾现象（无降解）。 纯品纯品RNA和和DNA的的OD260/OD280（R）应为）应为2. 0和

9、和1.8，所以提取，所以提取RNA的的R值应保证在值应保证在1.82.0，R2.2表示有降解。表示有降解。Tris水溶解水溶解RNA应保证应保证2.0R2.2。 -70和和-20保存无明显差异，否则为内源性保存无明显差异，否则为内源性RNase污染。污染。 抽提产量较低抽提产量较低 1. 样品裂解不完全减少样品、延长裂解时间样品裂解不完全减少样品、延长裂解时间或加大提取液；或加大提取液；2. RNA未完全溶解，会带来未完全溶解，会带来OD比值过低延长比值过低延长溶解时间且溶解时间且RNA不可过分干燥；不可过分干燥；3. 实验材料质量不佳新鲜样品或生长旺盛细实验材料质量不佳新鲜样品或生长旺盛细胞；胞；4. 离心不够充分加大转速及延长时间。离心不够充分加大转速及延长时间。 RNA有降解有降解1. 样品不新鲜或提取过程时间有延误组织样样品不新鲜或提取过程时间有延误组织样边研磨边加入液氮；边研磨边加入液氮；2. RNA 存放不够低温存放不够低温-70；3. 提取液加入不足，内源提取液加入不足，内源RNase没被充分抑制没被充分抑制减少样品或加大提取液；减少样品或加大提取液；4. 外源外源RNase没被充分抑