疏水色谱201306051

1、疏水色谱的进展研究添加文本随着生命科学的发展,用生物技术生产的产品需要进行分离和分析。作为分离、纯化和制备生物大分子有效手段的高效液相色谱法(HPLC)在生物工程的下游技术中占有重要的地位。但是,众所周知,在生化分离过程中,普遍存在蛋白质易失活问题,特别是用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)纯化时,由于流动相中大量有机溶剂的存在,使蛋白质的生物活性难以保持。高效疏水色谱法(HPHIC)则克服了这一缺点。由于它是用含盐水溶液作为流动相,固定相的疏水性适中,具有分离条件温和、不损伤蛋白质活性、分离效率高以及柱容量大等优点,因此在生化分离中,特别在活性蛋白质的分离中,日益成为人们优先考虑的色谱分离

2、手段。前言目录疏水色谱法的理论疏水色谱法的理论疏水色谱法疏水色谱法的的固定相固定相疏水色谱法的应用疏水色谱法的应用添加文本疏水色谱填料是由化学性质稳定,机械强度好的载体(如琼脂糖、硅胶等)和疏水配基(如C6、C8等)组成。一般来说,蛋白质表面存在着一些疏水区域,借助于疏水区域和疏水配基间的疏水相互作用力,蛋白质被吸附在色谱填料的表面,并且高盐浓度可以加强这一作用力。因此,可以利用不同蛋白质间的疏水性差异,通过改变洗脱时的盐浓度就可以对蛋白质进行有效地分离纯化。一、疏水色谱法的理论研究疏水色谱法的理论研究二、疏水色谱法疏水色谱法的的固定相固定相非多孔填料非多孔填料有机填料有机填料无机填料无机填料

3、大孔膜大孔膜添加文本疏水色谱法固定相疏水色谱法固定相的发展与其它色谱法一样,HPHIC发展的技术核心仍然是研制和开发新型的色谱填料。添加文本在无机填料中,由于硅胶的机械性能好,孔结构和表面积易于人为控制,并有较好的化学稳定性,因此应用最广泛。但硅胶的pH值应用范围较窄(2. 08. 0),且残留在硅胶表面上的硅羟基会对蛋白质产生不可逆吸附。另外,硅羟基的解离也会使填料具有阳离子交换性质,从而使分离产生混合机理。为了克服这些缺点,近年来多用高分子涂层硅胶填料代替单纯的硅胶填料。这种填料通常选用合适的聚合物、寡聚物或单体,使其在硅胶表面上形成致密的聚合物涂层,它既具有高聚物的化学稳定性,又具有硅胶

4、基质的高机械强度。1.无机填料无机填料Schomburg和Petro已先后对聚合物涂层技术的发展作了评述。目前出现的HPHIC的涂层硅胶种类很多,如用乙烯基甲基二乙氧基硅烷与乙烯基吡咯在硅胶表面上聚合得到的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)涂层硅胶填料,对蛋白质和多肽具有良好的选择性。N-丁基聚丙烯酰胺涂层硅胶填料 以及通过戊二醛作交联剂制成的壳聚糖涂层硅胶填料,在分离生物大分子中各具特色。由于这些填料的硅胶表面上的硅羟基被高分子聚合物涂层掩盖,从而消除了分离过程中溶质的不可逆吸附及硅羟基的解离现象,并扩大了流动相使用的pH值范围。另外,高分子功能基多种多样,可制成多种疏水性不同的HPHIC填料。另一种

5、无机基质是可控孔玻球,在其表面键合不同分子量的聚乙二醇制成醚型疏水固定相,对6种标准蛋白质有良好的分离效果。在大孔玻球上涂上N-丁基聚丙烯酰胺制成的疏水色谱填料对细菌外源凝集素也有较好的分离效果。添加文本以硬质高聚物微球为基质的填料是HPHIC固定相中另一研究热点。这种基质具有良好的化学稳定性, pH值应用范围宽,不容易产生不可逆吸附作用,特别是它与生物大分子有良好的生物相容性, 分离过程中能保持样品的生物活性,另外,在聚合物的表面容易进行化学改性,可形成多种固定相。对高聚物微球的合成主要采用“二步溶胀法”,最近Ogino等作了一些改进,使其成为一步溶胀法。利用二步溶胀法相继合成出的填料有交联

6、聚苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油脂-二甲基丙烯酸乙二醇脂共聚物、乙烯苯酚-二乙烯共聚物以及甲基丙烯酸甘油脂-二甲基丙烯酸甘油酯等。这些填料表面经过一定的亲水改性,都有可能制成HPHIC填料,只是难易程度有所不同。用戊二醛对聚氨基葡糖表面进行化学改性制成的HPHIC固定相对6种蛋白质分离,效果良好。2.有机填料有机填料K leinmann等用2-羟乙基异丁烯与乙烯基二异丁烯共聚物直接制成疏水色谱填料,其分离效果不太满意,但用苯甲酰氯和1, 2-环氧-3-苯氧基丙烷对该填料进行修饰后,其分离效果大大改善。Sing等采用聚氧乙烯型非离子表面活性剂包覆RP-HPLC填料的方法,使其转变为HPHIC填料,也

7、取得较好的效果。关于有机基质的HPHIC填料,Rassi和卫引茂等最近分别作了评述。一种用“孔径比”衍生法制成的新型填料缩水甘油甲基丙烯酸脂-乙烯-二甲基丙烯酸酯共聚物poly (glycidyl methacrylate-co-ethylene )dime-thacrylate单分散颗粒,使一根色谱柱具有HPHIC和RP-HPLC两种性能。这种填料中大孔径表面的苯基密度小,并分散有亲水官能团,而小孔径表面的苯基密度高,因此用这种填料装填的色谱柱既可在HPHIC体系中分离蛋白质,又可在RP-HPLC体系中分离糖和药物。上述多孔填料虽然柱容较高,但柱效和分离速度相对较低。为了提高生物大分子的分析

8、速度,出现了非多孔填料以及大孔膜、连续床柱等新型载体。添加文本这种填料粒度一般为13m,在分离过程中可有效地避免溶质在固定相颗粒内部的吸附和扩散,使溶质在固定相与流动相之间能进行迅速的质量迁移,而且由于粒度小、刚性好,对改善柱效、提高样品回收率、保持溶质分子的生物活性都十分有利,特别适合于生物大分子的高分辨分离与快速分析。目前,以硅胶和聚合物为基质的非多孔型HPHIC固定相均有报道,比如在硅胶表面键合聚醚制成的非多孔硅胶填料能在2m in内对4种蛋白混合物进行快速分离。将大孔琼脂糖凝胶经收缩、交联和非极性配基衍生制成的非多孔树脂以及在亲水高聚物表面键合丁基制成的非多孔树脂也很有特色。在含有环氧

9、基的交联共聚物微球上键合PEG制成非多孔树脂亦取得较好的效果。3.非多孔填料非多孔填料添加文本高效膜色谱法是一种新型色谱方法,它采用容量大、渗透性好的膜作为载体,最大特点是不用复杂的仪器,并且能将膜分离过程中分离速度快、处理量大等优点与柱色谱法中选择性好、分离效率高、负载量大等优点有效的结合起来,分离速率比HPLC柱高23个数量级。关于大孔膜的研究主要集中于亲和膜和离子交换膜,Kubota等利用辐射诱导接枝法制成的疏水大孔膜在分离和制备生物大分子方面颇具特色。Tennikova等用甲基丙烯酸缩水甘油酯-辛基甲基丙烯酸-二甲基丙烯酸乙烯交联得到的三元聚合物膜为基体,分别制成了离子交换、疏水、反相

10、大孔膜,并利用混合蛋白质研究了置换剂浓度、流速、梯度斜率等对分离结果的影响。4、大孔膜、大孔膜三三、疏水色谱法的应用、疏水色谱法的应用大分子的大分子的分离和纯化分离和纯化蛋白质分子构象变化蛋白质分子构象变化变性蛋白质的复性变性蛋白质的复性蛋白质折叠机理蛋白质折叠机理添加文本能够用HPHIC分离、纯化的蛋白质种类很多,其分子量从6 000左右的胰岛素到10万以上的红细胞和淋巴细胞。这里不可能一一详述,仅举出一些实例来说明近年来HPHIC在生物大分子分离、纯化中所占的重要地位。1、HPH IC在生物大分子分离和纯化方面的应用添加文本添加文本应特别指出,纯化重组人干扰素-V(rIFN-V)的方法通常

11、是通过提取包含体,然后进行分离、纯化,再经透析或稀释使之恢复生物学活性。但这种方法活性回收率低,操作时间长,而且纯化效率也较低。利用HPHIC法可直接将rIFN-V的盐酸胍破碎菌体提取液进行HPHIC分离。一步纯化就使rIFN-V的纯度达到85%以上,比活达5. 71010IU /g,其活性回收率是通常方法的23倍。以往从血清中分离、纯化铁传递蛋白的方法包括多步色谱分离,并需数日才能完成。V ieira等利用HPHIC对鸡血清进行一步纯化获得铁传递蛋白(transferrin)取得较好的结果,一次可以从3mL血清中纯化得到12mg(80% )的铁传递蛋白,而这一工作仅需几小时就可完成。由此看来

12、,用HPHIC进行生化分离、纯化,不仅活性回收率高,而且操作步骤也简化了许多。添加文本将HPHIC作为一个有效的工具用于脲或胍等变性蛋白质的复性取得了成功。将盐酸胍变性的牛血清蛋白(BSA )、溶菌酶(Lys)、核糖核酸酶(RNase)混合蛋白质通过HPHIC柱,能在30m in内获得除去变性剂、分离和完全复性三重功效。盐酸胍变性的T淀粉酶(Amy)也能得到部分复性。在上述的rIFN-V的制备中,HPHIC也能使盐酸胍变性的rIFN-V完全复性。2、HPH IC用于变性蛋白质的复性用于变性蛋白质的复性添加文本HPHIC对变性蛋白可以起到分离和复性双重作用,但对于那些不能用HPHIC完全复性的变

13、性蛋白,如脲变T-Amy,用HPHIC则可进行变性T-Amy的折叠中间体分离及蛋白质变性机理的研究。Bai等对此做了大量的工作,结果表明,盐酸胍和脲使T-Amy的变性机理及在疏水界面上折叠形成的中间体数目均不相同,脲变T-Amy折叠中间体的疏水性大小接近于连续,中间体的数目随色谱条件的不同可能是变化的。3、HPH IC用于蛋白质折叠机理的研究用于蛋白质折叠机理的研究添加文本4、HPH IC用于蛋白质分子构象变化的研究用于蛋白质分子构象变化的研究根据HPHIC中的SDM -R, lgk对lgH2O作图得到的斜率Z表示1mol溶质被固定相吸附时从溶质与固定相间被置换的水的摩尔数。当蛋白质构象一定时

14、,同一溶质的Z值通常为一常数。但当蛋白质构象发生变化时,从溶质与固定相间被置换的水的摩尔数就会发生变化,即Z值改变。因此Z值可作为表征蛋白质分子构象变化的参数。目前在HP-HPLC中利用Z值来研究蛋白质构象变化已引起国际上的普遍关注12, 5456。在HPHIC中,由于蛋白分子不像在RP-HPLC中那样几乎完全处于变性状态,而是疏水区域不断的收缩与扩张引起某些局部构象的变化,其Z值变化情况就要复杂得多,因此研究HPHIC中蛋白质构象变化所引起的Z值变化对于捕捉蛋白分子构象变化的中间过程信息有着深远的意义。添加文本展望展望HPHIC的出现和发展虽然只经过了一个较短的时间,但它在生物大分子分离、纯化方面的优越性已十分