综合实训配套PPT-食品中金黄色葡萄球菌定性检验

1、食品微生物检验技术 综合实训6金黄色葡萄球菌定性检验 3 实验材料和设备 1 1实验操作2 2目录页CONTENTS PAGE结果与报告3 3原始数据记录表4 4 4 一：实验材料与设备除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：天平均质器超净工作台生物安全柜恒温恒湿培养箱高压灭菌器无菌吸管微量移液器及吸头无菌试管接种环涂布棒1、设备和材料 5 一：实验材料与设备2、培养基和试剂（1）样品稀释液：样品罐（含225ml生理盐水或磷酸盐缓冲溶液）、无菌试管（含9ml生理盐水或磷酸盐缓冲溶液） （2）无菌器材：微量移液枪及无菌吸头以及若干无菌涂布棒。 （3）分离平板：baird-park

2、er（BP）琼脂平板；其中BP琼脂培养基需按照95mL的倍数配制，高压灭菌后，冷却至50，每95mL加入预热50的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL，摇匀后倾注平板，培养基应是致密不透明的，使用前在冰箱保存不得超过48h。 （4）纯化平板：营养琼脂平板或营养琼脂小斜面，以备血浆凝固酶结果可疑时备查。 （5）鉴定试剂：脑心浸出液肉汤（BHI）、冻干兔血浆。 6 一：实验材料与设备3、实验室要求及个人防护用品实验室要求及个人防护用品实验室要求：实验根据GB 4789.1-2010食品安全国家标准 食品微生物检验 总则中要求，一般样品检验在洁净实验室中进行，病原微生物分离鉴定在二级生物安全实验室（BSL-2）

3、中进行。 该实训要求样品稀释与接种过程在无菌室内进行，典型菌落的计数与确认在BSL-2实验室中进行。无菌室个人防护用品有：无菌工作服、一次性口罩、帽子和无粉乳胶手套。BSL-2实验室个人防护用品有：防渗透工作服，一次性口罩（有条件者备N95口罩）、帽子、无粉乳胶手套及聚氯乙烯手套各1副。 7 二：实验操作过程在无菌室内，以75%酒精擦拭样品外包装，尤其是包装的开口处，用无菌剪刀在样品封口处剪开包装袋，用75%酒精擦拭沙拉酱瓶口，无菌操作打开瓶盖及密封锡箔纸，将沙拉酱样品挤出至无菌罐内，用无菌药匙称取25 g样品至盛有225 mL 生理盐水的样品瓶中，再转入注明样品信息、检测人员以及检测日期的均

4、质袋中，密封，用拍击式均质器拍击2 min。制成10-1 的样品匀液，并做好标记。1、样品处理、样品处理 8 二：实验操作过程1、用记号笔在稀释液试管上作-2和-3的稀释度编号。取出平皿，用记号笔在BP平板皿盖边缘作如-1 0.3、-1 0.3和-1 0.4；-2 0.3等各稀释度和接种量的编号及空白对照编号。 2、吸取10-1样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中，（注意吸头尖端不要触及稀释液面），漩涡振荡试管使其混合均匀，制成10-2的样品匀液。吸取10-2 样品匀液进行十倍递次稀释。注意：制备10倍系列稀释样品匀液时，每递增一次，换用1次1 mL 无菌吸头。2、

5、样品样品的的稀释稀释与接种与接种 9 二：实验操作过程3、根据对样品污染状况的估计，选择 23 个适宜稀释度的样品匀液，在进行 10 倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取 1 mL 样品匀液以 0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接种量分别加入三块BP平板，然后用无菌L型涂布棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。注意：使用前，如BP平板表面有水珠，可放在 25 50 的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。2、样品样品的的稀释稀释与接种与接种 10 二：实验操作过程3、培养 涂布后，将平板静置 10 min，如样液不易吸收，可将平板放在培养箱361培养 1 h；等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置

6、于培养箱，361培养45 h48 h。 11 二：实验操作过程4、典型菌落计数与确认（1）典型菌落特征：金黄色葡萄球菌在 BP平板上，菌落直径为 2 mm3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。 12 二：实验操作过程4、典型菌落计数与确认（2）计数：选择有典型金黄色葡萄球菌菌落，且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20 CFU200 CFU之间的平板，计数典型菌落数。如果符合以下

7、4种情况：1.只有一个稀释度平板的菌落数在20 CFU200 CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；2.最低稀释度平板的菌落数小于 20 CFU 且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；3.某一稀释度平板的菌落数大于200 CFU 且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落； 13 二：实验操作过程4、典型菌落计数与确认4.某一稀释度平板的菌落数大于200 CFU 且有典型菌落，且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的菌落数不在20 CFU200 CFU 之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落；则按下面的公式（1）计算。T AB / Cd.

8、 （1）式中：T样品中金黄色葡萄球菌菌落数；A某一稀释度典型菌落的总数；B某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数；C某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数；d稀释因子。 14 二：实验操作过程4、典型菌落计数与确认5.如果有2个连续稀释度的平板上的菌落数均在 20 CFU200 CFU 之间则按下面的公式（2）计算。T （A1B1/ C1A2B2/ C2）/ 1.1d（2）式中：T 样品中金黄色葡萄球菌菌落数；A1第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落的总数；A2第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落的总数；B1第一稀释度（低稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数；B2第二稀释度（高稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数；C

9、1第一稀释度（低稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数；C2第二稀释度（高稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数；1.1计算系数；d 稀释因子（第一稀释度） 15 二、实验操作过程4、典型菌落计数与确认6.如该样品各稀释度均无菌落生长，且最低稀释因子为10-1，则报告10 CFU/mL 以本实验为例，10-1 稀释度上三个平板上的菌落数分别为180，240和240，10-2稀释度上三个平板上的菌落数分别为19，24和23，10-3释度上三个平板上的菌落数分别为4，4和2。可见，其中10-2稀释度上三个平板上的菌落数之和为66，在20 CFU200 CFU 之间，其他两个稀释度不在该范围内，因此应按

10、照公式（1）计算结果 16 二：实验操作过程血浆凝固酶试验本实验从10-2稀释度的平板上的典型菌落中任选5 个菌落（如果小于5 个则全选），分别接种到 BHI中，在361培养箱中培养 18 h24 h后，取BHI 培养物 0.20.3 mL加入到已用0.5 mL无菌生理盐水完全溶解的冻干兔血浆安瓿瓶中，振荡摇匀，置 361培养箱中培养， 6 h内观察凝固现象。每半小时观察一次，如兔血浆呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，则判定为阳性结果。注意：该试验须同时以血浆凝固酶试验阳性（如金黄色葡萄球菌标准菌株）和阴性葡萄球菌菌株（如表皮葡萄球菌或白色葡萄球菌标准菌株）

11、的新鲜肉汤培养物作为对照。以本实验为例，金黄色葡萄球菌标准菌株和待检菌均为凝固，表皮葡萄球菌不凝固，判定该待检菌为阳性。本实验选取的5个菌落血浆凝固酶试验均为阳性反应，均确认为金黄色葡萄球菌 17 三：结果与报告结果报告根据BP平板上金黄色葡萄球菌的典型菌落数以及血浆凝固酶试验确认结果，按公式计算，报告每g (mL)样品中金黄色葡萄球菌数，以CFU/g (mL)表示。以本实验为例，10-2稀释度上三个平板上的菌落数之和为66，在 20 CFU200 CFU 之间，从该稀释度上选取的5个菌落做血浆凝固酶试验均为阳性，因此按公式（1）计算：T AB / Cd = 6600。6610-2稀释度典型菌

12、落的总数；分子510-2稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数；分母510-2稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数0.01稀释因子，即10-26600样品中金黄色葡萄球菌菌落数；因此，最终报告6600 CFU/g，即每克样品中金黄色葡萄球菌菌落数为6600CFU。 18 四：原始数据记录表检验人员/日期: 校验人员/日期: 样品编号样品编号 样品名称样品名称 样品状态：固态，无异常样品状态：固态，无异常 液态，无异常液态，无异常 其他：其他：检测依据：检测依据： GB 4789. 10-2010 第二法第二法仪器状态： 正常 异常检测地点：302微生物室 主要检测仪器名称及编号：主要检测仪器名称及编号： J

13、M049 GHP型隔水式恒温培养箱型隔水式恒温培养箱 JM064 超净工作台超净工作台 JM079 显微镜显微镜 计算公式： T=AB/CdT样品中金黄色葡萄球菌菌落数； A某一稀释度典型菌落的总数； B某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数；C某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落d稀释因子。 T=（A1B1/C1+A2B2/C2）/1.1dA1第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落的总数； A2第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落的总数； B1第一稀释度（低稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数；B2第二稀释度（高稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数； C1第一稀释度（低稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数； C2第二稀释度（高稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数；样品前处理（无菌操作）： 检样25g（mL）+225mL灭菌生理盐水(或磷酸缓冲液)于无菌均质袋，进行均质处理。主要培养基和试剂：主要培养基和试剂：培养基和试剂购自北京陆桥公司培养基和试剂购自北京陆桥公司样品序号样品序号检测项目培养条件样品不同稀释度（d）培养基平板上菌落数(A)不同稀释度血浆凝固酶试验结果CFU / gC