第2次课-生化-天然产物化学(研究方法)

1、第二讲第二讲 天然药物研究与开发天然药物研究与开发一、天然药物的研究开发程序二、天然药物中生物活性成分的研究方法三、我国中药、天然药物化学研究存在的主要问题。一、天然药物的研究开发程序一、天然药物的研究开发程序（一）（一）从天然药物或中药中开发新药的五种从天然药物或中药中开发新药的五种形式形式：1. 经过文献资料或民间用药的调研或通过现代药理学的筛选研究，发现某种动物、植物、矿物或微生物具有药用价值，然后将其开发成新药。2. 已知某种成分或某类成分具有药用价值或已成为新药，根据动植物的亲缘关系，寻找含有这种或这类成分的动植物，进而将其开发成新药。3. 在不明确有效成分的基础上，将临床疗效明确的

2、经典方、经验方或经药效学研究具有开发价值的复方中药开发成新药，或将现有新药改变剂型。4. 在基本上搞清了有效成分和有效部位的基础上，将有效部位开发成新药。5. 通过天然药物或中药中的有效成分或生物活性成分的研究，从中发现有药用价值的活性单体或潜在药用价值的活性单体即先导化合物先导化合物。什么叫先导化合物呢? 有一定的生物活性，但因其活性不够显著或毒副作用较大，无法将其开发成新药的具有潜在药用价值的化合物。（二）（二）天然物药品（一类新药）的开发研天然物药品（一类新药）的开发研究过程究过程：临床前临床前临床临床试生产试生产1.活性跟踪指导下的活性成分(结构新颖和作用机制新颖)的提取分离与结构鉴定

3、将是天然产物化学研究的主要形式。2.选定研究对象收集资料筛选活性有活性者跟踪分离得单体或活性部位确认结构动物试验（药效、毒性、药代） 申报临床研究临床研究（1、2期） 申请新药证书及生产批文号试生产（3期） 正式生产。（原料供应保障研究、制剂工业化研究。需1015年时间、1.52.5亿美元）二、天然药物中生物活性成分的研究方法二、天然药物中生物活性成分的研究方法（一）天然药物及中药中原生生物活性成分（一）天然药物及中药中原生生物活性成分的研究的研究:1. 通过调研或广泛筛选需要开发的天然药物。2. 根据原料药中化学成分的性质将其粗分成几个部分，通过活性测试确定有效部位。3. 在活性测试指导下，

4、采用各种色谱方法和其它方法对活性部位进行跟踪分离，最终得到活性成分。文文 献献 古古 籍、民籍、民 族族 、 民民 间、临间、临 床床 名名 方、天方、天 然然 产产 物、国外天然药物、老药物、国外天然药物、老药活性筛选活性筛选收集样品收集样品提取提取粗提物粗提物体外方法体外方法体内方法体内方法有活性有活性无活性无活性分离分离结构鉴定结构鉴定活性跟踪活性跟踪有效部位有效部位有效成分有效成分活性先导化合物活性先导化合物结构优化结构优化构效关系研究构效关系研究活性化合物活性化合物新药研发新药研发新药研发新药研发有效部有效部位新药位新药有效成有效成分新药分新药新药研发新药研发新化学药新化学药代谢产物

5、代谢产物体内代谢研究体内代谢研究活性筛选活性筛选活性化合物活性化合物4. 根据理化性质和波谱数据确定单体的化学结构，进行活性评价。5. 对有开发价值的化合物进行结构修饰和构效关系的研究，进而将其按国际惯例开发成创新药物。 从天然药物或中药中开发创新药物的关键是能否从天然药物或中药中分离得到有药用价值药用价值或潜在药用价值潜在药用价值的活活性化合物性化合物； 中药是创新药物及其先导化合物的重要来源。 基于高通量活性筛选跟踪的活性成分研究基于高通量活性筛选跟踪的活性成分研究细胞、靶酶水平细胞、靶酶水平的高通量筛选的高通量筛选亲和色亲和色谱技术谱技术生物芯生物芯片技术片技术中药样品中药样品粗提物粗提

6、物分离部位分离部位单体化合物单体化合物分子烙分子烙印技术印技术（二）天然药物及中药中前体活性成分的研究（二）天然药物及中药中前体活性成分的研究 有些中药中的化学成分本身并无生物活性，但经体内代谢后所产生的代谢产物具有很强的生物活性（前体药物prodrug）；例如：秦皮素 3,4-二羟基苯丙酸（抗菌）（体内代谢）体内代谢法： 即将天然药物或其成分给动物食用后，分别收集动物的粪便、尿、胆汁，然后采用各种提取分离方法分离它们中的代谢产物，并采用谱学和与标准品对照的方法确定它们的化学结构，在化学结构已知的情况下进行生物活性评价，对有开发价值的化合物再进一步开发。（三）血清药化学和血清药理学（三）血清药

7、化学和血清药理学 除了治疗消化道系统或某些特殊的成分，通常天然药物中成分只有吸收入血吸收入血后才能发挥药效。 目前进展就较慢，原因如下： 不同化学成分在天然药物中含量相差巨大（百分之几至百万分之几）； 不同化学成分与血浆蛋白结合率不同； 同一成分在不同时间在血中含量不同（吸收入血成分很快被代谢、分布、排泄）； 天然药物成分在动物体内难以积累到足量样品； 结构测定方法有限，多数只能依靠LC-MS。（四）天然药物的化学修饰或结构改造（四）天然药物的化学修饰或结构改造 从天然药物或中药中筛选追踪得到活性化合物只是一类创新药物研究的前期阶段。不少天然活性化合物因为存在某些缺陷而难以直接开发利用： 药效

8、不理想； 存在一定的毒副作用； 含量太低，难以从天然原料中取材； 因结构过于复杂，合成也十分困难； 水溶性差、生物利用度差等等 以它们为先导化合物，在经过一系列的化学修饰或结构改造后，对得到的衍生物进行定量构效关系比较研究，可能发现比较理想的活性化合物，并开发成新药。 例 青蒿素的构效关系研究 4.4.数据库检索数据库检索5. 5. 活性化合活性化合物的分离和物的分离和结构鉴定结构鉴定3.3.联用光谱联用光谱MSUV2 2. 生物活性测试生物活性测试1. HPLC 分离分离HPLC天然药物（五）从中药或天然药物中跟踪分离活性化合物一级色谱一级色谱二级色谱二级色谱三级色谱三级色谱高通量筛选高通量

9、筛选LC-MS、LC-NMR色谱高通量筛选快速结构鉴定色谱高通量筛选快速结构鉴定(LC-MS、LC-NMR)联用技术联用技术流流份份Planta Med. 67, 411-16 (2001)0102030405060I II III IV V VI VII VIII IX X XICOX-2 Inhibition in Mono Mac 6 cells %Injected: 200 gFor bioassay: 50 gTryptanthrinNNOOIndirubinONHNHOPlanta Med. 68, 64-5 (2002)MeOH Extract of SupernatantCol

10、umn ChromatographyHPLCGel ChromatographyCompounds 1 + 2RP low-pressure LC Kieselgel 60 F254; CHCl3-MeOH-H2O (65:35:5)1 Extrakt 22 1H-1H 仙鹤草根芽干粉 石油醚提取 残渣 石油醚提取物 （） 氯仿提取 残渣 氯仿提取物（） 乙醇提取 残渣 乙醇提取物（） 鹤草芽中驱绦有效成分agrimonophol的追踪分离： 仙鹤草根芽是蔷薇科植物龙牙草根茎的芽。民间用其干粉内服驱绦虫，疗效显著。但谓水煎液无效、醇浸后蒸去醇去渣(沉淀)服用也无效，连渣服用有效。研究者选用体外

11、灭囊虫试验，按下列程序进行活性追踪。 结果，石油醚提取物示有明显体外灭囊活性。TLC检查示含有十几种酚性成分。将石油醚提取物随用不同碱液作pH梯度萃取，由NaHCO3萃取部分分到有效单体鹤草酚，最后经一系列化学降解及光谱测试，确定结构如图所示，并经化学全合成得到确认。 CH3CH3OOHCH3CH2CH2COOHCH2HOCH3CH3OHCOCHCH2CH3OCH3鹤草酚（Agrimonophol）紫杉醇的发现紫杉醇的发现： 1971年：提取分离，结构确定，活性确认 1975-76年：在多种瘤株上实验有效； 1977年：临床前研究； 1979年：作用机理探明； 1982年：期临床实验； 198

12、5-86年：期临床实验(卵巢癌)； 1986年：紫杉醇侧链的全合成； 1988年：紫杉醇半合成； 1990-93年：侧链合成方法的改进； 1992年：FDA批准； 1994年：首次全合成。 红豆杉茎12kg浓缩物95%乙醇提取氯仿-甲醇萃取水层(弃去) 氯仿30管液滴逆流层析8-18管(14g,T/C=30%,23mg/kg)400管液滴逆流层析170-189管(2.4g,T/C=16%,15mg/kg)析出Taxol(0.5g,T/C=24%,5mg/kg)加苯研磨10974321HOCOCH3OOCOC C C OOHH HNHCOOCH3COOOHOHOHH喜树碱的发现： 喜树原料12k

13、g热正己烷提取正己烷提取物植物残渣(无活性,弃去)乙醇提取用4倍体积的氯仿+1/4体积的5%含水乙醇处理氯仿层(222g)(高活性)水层氯仿处理氯仿层(32g)水层(高活性)(低活性)NNOOOOHABCDF12310987654141211181920211716茜草根中抗肿瘤活性成分的追踪分离： 茜草根的抗肿瘤活性系采用S-180荷瘤小鼠进行体内抑瘤试验筛选过程中发现的。通过活性成分的追踪分离；最后得到了具有抗肿瘤活性的RA-5及RA-7等环肽类活性物质。 HNOOCH3NOHNNHOROOOOONRA-5 HRA-7 CH3R 分离过程中，活性测试系在接种了p-388白血病瘤细胞的CDF

14、l系小鼠身上进行。每个小鼠接种的瘤细胞数为1106。抑瘤活性以给药组动物平均存活天数（T）相对于对照组动物平均存活天数（C）的百分率，即延命效果（T/C）表示。T/C125时始认为有活性。 各个分离部分或馏分的活性筛选均按等剂量原则进行。甲醇、苯、乙酸乙酯及水提取物均按200 mg/kg小鼠剂量进行投药，但从苯提取物出发分离得到的各个组分，以苯提取物数量为100时各个馏分的收率为Y，按200 (Y/100) mg/kg小鼠剂量投药。故实际上各个组分（子体）的投药剂量与苯提取物（母体）投药量相当，测得的活性强弱有定量比较意义。 投药方法均为腹腔注射，每日1次，从植入肿瘤细胞后次日起连续进行5天。

15、说明：说明：（六）天然药物中生物活性成分研究需（六）天然药物中生物活性成分研究需要注意的几个问题要注意的几个问题:1.创新药物的开发是一个高技术、高风险、高投入、高回报、知识密集型的系统工程, 涉及化学、药理、制剂、临床医学、毒理等多学科领域。（1个创新药物需 1012年，耗资23亿美元；但年销售额可达百亿美元）创新药物与活性化合物是两码事（体内药效、毒性、临床疗效、制剂、吸收、分布、代谢、排泄、原料、成本、市场）。要注重知识产权的保护（活性部位或活性单体）。2. 选择适当的活性测试方法 天然活性化合物的追踪分离能否取得成功，关键在于有无好的生物活性测试体系。试验模型可以有整体动物、器官、组织

16、、细胞、酶或受体以及体内生物活性物质等。近来并已开始注意在基因调控水平上建立起新的筛选体系。（1）动物模型优点：采用整体动物进行的试验与人比较相近。缺点：实验费时费钱，现象复杂，而且动物个体差异以及病理模型难于建立。 用动物模型作为指导分离过程的活性筛选方法不太适宜。 （2）体外模型优点：灵敏、简便、可用于微量样品的测试。利用对酶、受体或体内生物活性物质的抑制或促进作用，以及利用基因调控影响进行的活性测试方法简便易行、可定量。缺点：有时体外活性测试方法所得结果与药物实际在体内的作用并不平行。 体外活性测试方法在实际工作中得到越来越广泛的应用。3. 确保供试材料具有活性 这是追踪分离活性化合物的

17、前提。为了确保活性成分的分离工作在可靠的基础上进行，对供试天然药物或中药有时须采用多项指标、体内外结合进行测试加以确认。 植物粗提物 体外多项指标筛选抗肿瘤活性 示有抗肿瘤活性 体内筛选抗肿瘤活性（P-388荷瘤小鼠） 有抗肿瘤活性 无抗肿瘤活性 确定抗肿瘤活性或作用机制有无新颖性 萃取分离 示有新颖性 萃取物 体外筛选抗肿瘤活性 追踪分离活性成分 示有抗肿瘤活性 体外复筛抗肿瘤活性 有活性 无活性（弃去） 美国国立癌症研究中心筛选抗肿瘤活性粗提取物的方法:优点： 活性低或含最少的化合物不至于丢失； 增加了检出新化合物的机会； 可能分离得到具有不同作用机制的化合物。4、在众多生物活性中力求找出

18、最本质的作用 天然药物或中药在临床治疗上可能作用于多个靶点，因而具有多种疗效，即表现出多方面的活性。研究者应当力求找出其中最本质的作用，选择建立反映临床治疗作用特点、且效果与之平行的活性测试体系，才有可能追踪分离出目的活性成分或甚至有效成分。供试材料 生理作用 生理活性测定方法 目的活性物质 乌头 强心、利尿、兴奋、镇痛 离体蛙心 去甲基乌药碱 大黄 健胃、缓泻 致泻活性(小鼠) 番泻苷 茵陈蒿 利胆、抗炎 胆汁分泌促进作用 茵陈色原酮等 贝(日本产) 口渴、视力减退、瞳孔散大、言语障碍、便秘 小鼠散瞳率试验 surugatoxin 软紫草 止血、抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌 前列腺素合成抑制活性

19、 arnebinol arnibinone arnebifuranone 5、注意正确比较并判断各个组分的活性 分离过程中总是按“等剂量不等强度原则”对每一阶段得到的组分（子体）进行活性定量评估，并与母体作比较，追踪活性最强组分。 如果与母体比较，所得几个子体活性强弱参差不齐，则示活性分离与物质分离平行，预示可能得到良好的分离效果； 如果某个子体活性显著增强，则示分离过程中可能除去了某种拮抗作用物质。具有良好的物质分离与活性分离。 如果所得各个子体活性均见明显减弱，则提示活性成分可能分解、流散、或因吸附剂发生不可逆吸附所致，或因该药物的活性原本为多组分的综合作用，故分离后反而导致活性的减弱或丧失。 具体问题宜具体分析，在查明原因后立即采取相应对策处理。分离过程中应配合活性测试，采用多种分离手段以求获得良好的分离效果，并应尽量避免采用可能导致活性成分分解或不可逆吸附的方法或试剂。五、我国中药、天然药物化学研究存在的六个主要问题。1.