克隆基因的诱变

1、克隆基因的克隆基因的诱变诱变诱变育种:以诱发基因突变为目的一种育种方法。 1、缺失诱变：用可从凹进的3端沿3到5端方向移去一条链的外切核酸酶进行单向缺失，再用一种单链特异性异性核酸酶制成平末端用于连接，经转化产生具缺失的克隆。2、定点诱变：在一个特定位点改变一个或几个核苷酸通常需要将诱变引物与模板退火，再用DNA聚合酶合成互补链。3、PCR诱变：用正向与反向突变的引物及可结合常用载体序列的另一对引物，进行两组PCR反应来分别扩增待突变的DNA的5与3部分。然后将这两组PCR产物混合，并进行只用外部引物的另一PCR。这些产物中部分再通过亚克隆代替最初步分子中要突变的区域 缺失诱变 S1核酸酶核酸

2、酶 ：来源于稻谷曲霉(Aspergillusoryzae)，是一种高度单链特异的核酸内切酶，在最适的酶催反应条件下，降解单链DNA或RNA，产生带5，-磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。 S1核酸酶的单链水解功能可以作用于双链核酸分子的单链区，并从单链部位切断核酸分子，而且这种单链区可以小到只有一个碱基对的程度。由于具备这种功能，使S1核酸酶在分析核酸杂交分子(RNA-DNA)的结构、给RNA分子定位、测定真核基因中间隔子序列的位置、去除去除DNADNA片段中突出的单链尾片段中突出的单链尾，以及打开在双链cDNA合成期间形成的发夹环。绿豆核酸酶绿豆核酸酶 ：来源于绿豆芽的核酸酶。将单链DNA降解为5端

3、带磷酸基团的单核苷酸或寡核苷酸。双链DNA、双链RNA及DNA与RNa杂交体对此酶相对不敏感。但此酶大量时也能将双链核酸完全降解。其物理性质及催化性质与S1核酸酶相似，但绿豆核酸酶的作用比S1酶更温和。用于使DNA突出端变为平端。 BAL 31 的主要活性为3“外切核酸酶活性。它可从线状DNA两条链的3”端去除单核苷酸。BAL 31还是一个内切核酸酶，因此利用其3“外切酶活性连续去除3”端单核苷酸后形成的单链DNA，可被BAL 31的内切酶活性所降解。 缺失诱变环状D N A分子 中较小片段的缺 失1、环状D NA的某一位点2、只有一个切点且切点位于该位 点附近的限制酶将环状DNA切成线状分子

4、3、外切核酸酶将线 状D N A 的沿3到5端方向移去一条链4、用一种单链特异性异性核酸酶（S1或绿豆核酸酶）或绿豆核酸酶）制成平末端用于连接5、用连接酶将切割后的线状D N A连接环化6、经转化产生具缺失的克隆 无论采用哪种内切酶,都可以通过控制 反应酶的浓度、反应时间、反应温度和其它 条件控制切割的程度。利用这 种方 法,可 以在 DNA 上制造 20 一20 0 0碱基对的缺失。定点诱变1、将一段合适的DN A片段克隆到 M13载体上,形成重组噬菌体 M13。2、从重组M13内制备单链的目的DNA3、设计并合成包含靶碱基的寡聚核苷酸4、将寡聚核昔酸与目的D N A杂交5、用 DNA 聚合

5、酶延伸寡聚核昔酸,完成互补链的合成6、传染敏感的寄主细菌细 胞7、筛选带有突变位点的噬 菌体8、从已突变了的重组噬 菌体内分离单链DNA9、对分离到的单链DNA进行 碱基序列分析再证实突变的可靠性。10、从复制型的双链重 组 M13内分离已突变了的D NA 片段11、用 突变的DNA 片段 代换 野生型D N A的相应片段 滚环式复制(rolling circle replication)是噬菌体中常见的DNA复制方式。滚环式复制的一个特点是以一条环状单链DNA为模板，进行新的DNA环状分子合成。噬菌体的双链DNA环状分子先在一条单链的复制起点上产生一个切口(nick)，然后以另一条单链为模板不断地合成新的单链。释放出的新合成的单链或是先复制成双链