基因工程复习资料

1、一、 名词解释1、限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。2、回文结构（palindrome）：序列正读和反读是一样的，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读序列是完全一样的。在切割位点处，限制性核酸内切酶的作用下磷酸二酯键会发生水解效应，从而导致链的断裂。3、基因组文库：提取染色体基因组DNA。如果要研究的是控制基因表达的调控序列，或是在mRNA中不存在的某种特定序列。4、cDNA文库：mRNA反转录成的cDNA。如果研究的目标是弄清一种蛋白质的氨基酸序列，可以根据克隆的cDN

2、A分子的核苷酸序列推导出来。5、荧光定量PCR： 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。6、Ct值的定义：扩增产物的相对荧光强度达到设定的阈值时所经过的循环数。7、基因重组：是依赖于限制性核酸内切酶、DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对外源目的基因的片段和表达载体DNA进行适当切割和修饰后，将外源片段和表达载体巧妙的连接起来，再转入受体细胞，实现目的基因在受体细胞内的正确表达。8、转化：大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。转染：大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。转导：借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。9、1.核酸探针

3、：核酸探针是指带有标记的与目 的基因同源互补的一段核苷酸序列。 大小：长度以50-300个碱基为宜 种类：DNA探针、CDNA探针、RNA探针 10、基因表达：是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。11、转基因食品（Genetically Modified Foods，GMF）是利用现代分子生物技术，将某些生物的基因转移到其他物种中去，改造生物的遗传物质，使其在形状、营养品质、消费品质等方面向人们所需要的目标转变。 12、原核生物的表达是以操纵子为单位的。Z编码-半乳糖苷酶；Y编码-半乳糖苷透过酶；A编码-半乳糖苷乙酰基转移酶。 13、载体：携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫做

4、载体 14、质粒：是染色体以外能够自主复制的双链闭合环状DNA分子，它广泛存在于细菌细胞中。二、 简答题1、Klenow酶的基本性质：1)大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端2）三分之二的大肽段，即为Klenow酶3)Klenow酶仍拥有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但失去了53的核酸外切酶活性2、Klenow酶的基本用途 1）补平由核酸内切酶产生的5粘性末端2）DNA片段的同位素末端标记3）cDNA第二链的合成4）双脱氧末端终止法测定DNA序列3、DNA连接酶的基本性质 修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键 4、基因组文库构建的一般步骤（1） 基因组DNA的提取（

5、2）DNA克隆片段的制备（3）载体与基因组DNA大片段的连接4. 基因组文库的大小5. 基因组文库的扩增及保存5、构建cDNA文库的一般步骤6、PCR的基本原理及步骤类似于DNA的体内复制PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：7、PCR反应体系缓冲液 dNTP 引物 模版 DNA聚合酶8、烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：1）吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上2)注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞3)转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所4)合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白

6、质5)组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒6)释放 子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来9、DNA分子的转化过程 吸附:完整的双链DNA吸附在受体菌表面 转入:双链DNA分子解链 单链DNA进入受体菌,另一链降解 自稳:单链DNA在细胞内复制成双链环状 表达:外源基因同复制子同时复制、转录、翻译 10、提高外源基因表达效率的方法 1）选择强启动子序列，如tac 等 2）调整S-D序列与AUG碱的距离 ， 一般为5-9bp 3）改变起始密码下面的几组密码子 ，能提高翻译的起始效率 4）增加mRNA的拷贝数和稳定性 5） 减轻宿主细胞的代谢负荷 6）提高表达产物的稳定性11、外源基因在原核

7、细胞中表达具备条件 1）通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白。 2)外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA。 3)必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表达。 4)外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架(ORF)。 5)利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。 12、pBR322的三个亲本：pSF2124、pSC101、pMB1第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（ampr）；第二部分来源于pSC101质粒的

8、四环素抗性基因（tetr）；第三部分来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。13、基因工程的基本过程.1）基因的剪刀限制性内切酶（限制酶）基因操作的过程（连） DNA连接酶3） 基因操作的过程（转） 运载体4） 基因操作的过程（增） 转化细胞5） 基因操作的过程（检） 筛选鉴定转化细胞三、论述题1、PCR常见问题及解决办法一）扩增不出特异性带1、原因 （1）引物设计有问题（引物位置错误，引物之间太强的相互作用） （2）反应体系有问题（3）退火温度太高 2、解决办法：（1）确认引物正确性（2）用保证能扩增出来的引物验证反应体系 （3）采用梯度PCR功能，寻找最适合的退火温度二）扩增带很弱 1、原因：（1）反应体系效率低（2）退火温度太高（3）很多非特异性扩增（4）大量引物二聚物的形成 2、解决办法：（1）用已确认的引物验证 （2）采用梯度PCR功能寻最适的退火温度（3）采用定量PCR的熔点曲线功能分析，提高退火温度，改变反应体系的PH值（三）非特异性扩增带很多 1、原因： （1）退火温度太低（2）反应体系有问题2、解决办法：（1）采用梯度PCR功能寻找最佳反应温度（2）更换反应体系 （四）引物二聚物太多1、原因：（1）引物设计有