叶酸检测方法研究进展 论文

1、叶酸检测方法研究进展叶酸检测方法研究进展 论文论文关键字：方法 血清 不同 微生物 谷氨酸 叶酸 结果 检测 放射 免疫法1942 年，Stokstad 首次成功地合成了叶酸，并阐明了叶酸的化学结构。半个世纪过去了，叶酸一直是学术界的研究热点。目前的研究证实，妇女孕前或妊娠早期缺乏叶酸是神经管畸形发生的重要病因之一1。叶酸与同型半胱氨酸代谢关系密切，对预防心血管疾病的发生具有重要的生物学意义2。叶酸是一组化学结构相似，生化特性相近的化合物统称，是由喋啶、对氨基苯甲酸和 1 个或多个谷氨酸结合而成。食物中的叶酸绝大多数是以喋酰多谷氨酸(或称多谷氨酸叶酸)的形式存在的。食物叶酸经小肠粘膜细胞内特异

2、叶酰多谷氨酸水解酶的作用，水解为喋酰单谷氨酸(或称单谷氨酸叶酸，PteGlu)后吸收。吸收后的单谷氨酸叶酸一部分又转变为多谷氨酸叶酸，在肝脏、红细胞及其他组织细胞内贮存，其余部分则以单谷氨酸叶酸的形式分布于血浆、组织液、胆汁及尿液中。肝脏的叶酸浓度是血浆的几百倍，但其单谷氨酸叶酸浓度与血浆相近。叶酸以 8 种辅酶形式存在于生物体内，为一碳单位的载体参与嘌呤、嘧啶等重要物质的合成。用于评价人体叶酸营养状况最常用的检测指标是红细胞叶酸及血清或血浆叶酸。目前，叶酸的检测方法已有多种，其中微生物法、同位素放射免疫法的使用最为广泛。一、微生物法微生物法是检测生物体内叶酸的经典方法，通常所用的微生物有干酪

3、样乳酸杆菌（L.casei)、粪链球菌和啤酒小球菌属。此 3 种微生物对不同形式叶酸的敏感度不同。粪链球菌只对非甲基化叶酸敏感，如 PteGlu、二氢叶酸(DHF)和四氢叶酸(THF)，可用于鉴别分析各种形式叶酸在不同检测物的分布。L.casei 对单谷氨酸叶酸、含 2 或 3 个谷氨酸叶酸(PteGlu2、PteGlu3)及其还原型衍生物均敏感，是 3 种微生物中反应谱带最宽的一种，也是最为常用的菌种。它对含 7 个谷氨酸叶酸(PteGlu7)的敏感度很小，约为对 PteGlu 敏感度的1，故有人认为 L.casei 对超过 3 个谷氨酸基团的多谷氨酸叶酸无响应。但有研究发现，L.casei

4、 对 PteGlu4、PteGlu5、PteGlu6 和 PteGlu7 的敏感度分别为对 PteGlu 的 65.6、19.9、3.5 及 2.4，同时对某些形式的多谷氨酸叶酸的敏感度随培养时间的延长而增加，其机理有两种可能：其一，微生物在培养过程中合成水解酶，随培养时间延长，水解酶产量增加，促使部分长链谷氨酸水解断裂；其二，细菌在培养过程中细胞壁对多谷氨酸叶酸的通透性增加。所以，尽管 L.casei 对叶酸的反应谱带较宽，但如检测物中含有多谷氨酸叶酸须将样品在检测前加入多谷氨酸叶酸水解酶进行水解，使各种形式叶酸均转变成单谷氨酸叶酸，否则检测结果不能代表其叶酸总含量。传统的微生物学检测方法是

5、试管法，操作繁杂。1987 年，Newman 和 Tsai3在进行食物叶酸分析过程中，对传统的方法做了改良，将 96 孔酶标板和全自动酶标板读数仪(酶标仪)引进方法中，大大减少了试剂的消耗，缩短了加样及人工读取检测结果的时间。如使用在对数生长期冷冻保存的 L.casei 菌种或及对抗生素耐药菌株，还可使检测方法进一步简化。另有研究证实4，使用对数生长期 L.casei 菌种(ATCC7469)可使检测物培养时间从 3648 小时减至 18 小时。OBroin 和 Kelleher5用 L.casei 氯霉素耐药株(NCIB10463)对血清及红细胞叶酸进行检测，结果与传统的微生物法检测结果呈显

6、著线性相关(r 值分别为 0.975 和 0.96)。使用氯霉素耐药株，可以省略试剂过滤消毒及无菌操作等步骤。尽管微生物法灵敏度高，结果准确，但也有许多局限性，如整个实验周期长，批间检测结果重复性差，检测结果受样品中所含抗叶酸药物或抗生素成分的影响等。用-乳酰胺酶处理样品后，可消除青霉素和先锋霉素等抗生素对叶酸检测结果的干扰5。微生物法除可用于检测血清和全血叶酸外，还可用于检测纸血片叶酸6，检测结果为叶酸与血红蛋白的比值。由于纸血片标本制备技术简单，纸血片叶酸稳定性较好，故该法对大规模人群叶酸营养状况的流行病学调查具有重要的意义。二、同位素放射免疫法尽管微生物法得到各种改进，但仍因耗时大，操作

7、复杂而不能得到广泛使用。70 年代初，有学者提出 同位素放射免疫法检测血清叶酸。该方法具有快速、简便的特点，同时由于叶酸放射免疫试剂盒的出现，很快得到普及，尤其广泛应用于临床实验室。放射免疫法与微生物法检测叶酸，除原理不同外，检测结果的意义也有所不同。对大量标本总体而言，两种方法结果相关性较好，但对个体标本，两种方法结果的差异较大。微生物法对多谷氨酸叶酸响应值低，不能直接用于检测叶酸含量。但微生物法对所有单谷氨酸叶酸及其衍生物的反应灵敏度相同，故在用叶酸水解酶处理样品使所有叶酸形式转变为单谷氨酸叶酸后进行检测，可得到准确的叶酸值。同位素放射免疫法对多谷氨酸叶酸反应的相对灵敏度有较大的差别，随着

8、叶酸浓度增加，反应的相对灵敏度增加，但多谷氨酸叶酸的反应曲线不可能与单谷氨酸叶酸的反应曲线重合；另一方面，多谷氨酸叶酸与结合蛋白的亲合性与单谷氨酸叶酸相比较高，不同的单谷氨酸叶酸衍生物反应灵敏度不同，放射免疫法也不适用于检测单谷氨酸叶酸衍生混合物。由于上述原因，尽管放射免疫法可用于检测和评价叶酸的营养状况，但从定量检测的角度来讲，难以得到准确的叶酸含量值。目前用于检测叶酸的放射免疫试剂盒已有数种，其原理基本相同，但不同的试剂盒检测结果也有差异7,主要区别有如下几方面：竞争结合蛋白不同，或为猪血清结合蛋白，或为牛奶结合蛋白，或为-乳球蛋白。(l)-5-甲基四氢叶酸与猪血清结合蛋白的亲合力好于多谷

9、氨酸叶酸，后者又略好于单谷氨酸叶酸的其他衍生物，而 5-甲基四氢叶酸的 d 型异构体不能与猪血清结合蛋白结合；牛奶结合蛋白与单谷氨酸叶酸和（d,l）-5-甲基四氢叶酸具有相同的亲合力，但对单谷氨酸叶酸的其他衍生物的亲合力各不相同，对多谷氨酸叶酸的亲合力高于对其单谷氨酸叶酸衍生物；-乳球蛋白则对(d,l)-四氢叶酸的结合力较差。配制标准系列的溶液不同，主要有两种，即缓冲液和血清。用血清作配制溶液与用缓冲液作配制溶液的试剂盒相比，检测结果偏低。放射免疫法检测叶酸结果与试剂盒选择哪一种形式叶酸作标准品有关，如选择的标准品为(d,l)-5-甲基四氢叶酸，则使用此类试剂盒的前提便是假设检测物中绝大多数叶

10、酸是以此单一辅酶形式存在的，从而使检测结果与实际含量间的误差增大。以上所述的各种因素可能是造成目前各类试剂盒检测结果间差别较大的主要原因。所以，尽管各类试剂盒均有其相应的正常值参考范围，但各实验室还应结合与叶酸营养状况有关的其他指标，来确定本实验室的红细胞或血浆、血清叶酸正常值。三、其他方法1.气相色谱-质谱检测：血清或红细胞叶酸是目前用于评价叶酸营养状况的两个重要指标，且红细胞叶酸是反映体内叶酸贮存状况的客观指标，对诊断叶酸缺乏具有更为重要意义。微生物法、放射免疫法可以实现血清或血浆及溶血液叶酸含量的检测，红细胞叶酸均是通过某种数学公式，从溶血液叶酸、血清叶酸和红细胞压积等指标计算出来的。1

11、995 年，Santhosh-Kumar 等8提出用气相色谱-质谱检测的方法(GC-MS)检测红细胞叶酸含量，填补了直接检测样品红细胞叶酸浓度的空白，该方法特异性好，灵敏度高，且结果准确。2色谱分析法:以上所述各种叶酸的检测方法，其检测结果均为单或和多谷氨酸叶酸及其衍生物混合物的总量。即使是微生物法也因不同微生物对不同形式叶酸的生物利用率不同，无法进行某一种或某几种单谷氨酸叶酸衍生物的分析检测。70 年代，有学者提出应用色谱分析法，包括高效离子交换层析、离子对分配层析和高效液相色谱分析(HPLC)技术分离提取各种形式的叶酸，但由于叶酸浓度低于检测器检测下限，人们不得不在应用色谱技术分离提取叶酸

12、后，再用微生物学检测方法进行定量检测。因该方法费时，需要样品量较大，故其实际应用受到限制。HPLC-电化学检测方法对单谷氨酸叶酸及其衍生物的检测灵敏度高于紫外或荧光检测方法9，对四氢叶酸及 5-甲基四氢叶酸的检测灵敏度是微生物法的 1050 倍。此方法可用于人类及大鼠等多种生物样品叶酸检测，且检测前无需样品浓缩处理。这项技术的应用对体内叶酸吸收、代谢及转运等基础理论的研究具有重要意义。1996 年，Gunter 等7发现，HPLC对全血叶酸的检测结果与 Bio-Rad 放射免疫试剂盒对同份样品叶酸的测定结果相近，但血浆叶酸的测定结果仅为其他方法测定结果的一半，作者认为尽管HPLC 对 5-甲基

13、四氢叶酸特异性好，但在洗脱过程中有叶酸丢失的可能。HPLC技术复杂，不适用于临床常规检测。3离子捕获法:Wilson 等10提出离子 捕获法检测叶酸，该技术可谓叶酸检测技术中的最新方法，即在实验中，样品加入变性剂后叶酸与内源性结合蛋白分离，释放后的叶酸再与带有大量阴离子的亲合试剂结合，合成产物经过离子捕获池而与阳离子纤维结合，最后通过碱性磷酸酶与喋酸(叶酸的类似物)结合物对叶酸结合蛋白上游离结合位点的探查，定量分析样品的叶酸含量。该研究证实，离子捕获法测定血清或红细胞叶酸，其结果与同位素放射免疫法的结果具有良好的相关性，相关系数分别为 0.96 和 0.93。4其他方法:80 年代后期90 年

14、代，有学者相继提出用非放射性标记蛋白结合技术检测血液叶酸，其中包括克隆酶供体免疫测定法(CEDIA)11、酶联配体吸附试验(ELLSA)12、化学发光受体实验等13。CEDIA 方法的原理在激素、地高辛及其他维生素的检测中已有应用，其血清叶酸检测结果与放射免疫法相近，该方法检测速度约为放射免疫法的两倍，又无离子辐射，操作简单，可作为一般实验室常规检查。不足之处为费用高，约为放射免疫法的 23倍。化学发光法检测重现性好，灵敏度较高，对低浓度叶酸样品检测结果明显高于其他方法7。20 家研究所或临床实验室对目前用于检测血清及全血叶酸的几种方法进行了比较研究7，结果显示，血清叶酸和全血叶酸检测结果平均

15、变异系数分别为 27.6和 35.7，部分样品用不同方法检测的结果可相差 29 倍，表明不同实验室的叶酸检测结果差异较大，不同检测方法的检测结果之间可比性较差。这种差异不利于正确地客观地评价某人群叶酸营养状况，同时也给制定每日膳食叶酸供给量带来困难。随着叶酸在巨幼红细胞贫血、高同型半胱氨酸血症及神经管畸形的预防中的作用进一步明确，确定统一的检测方法和参照标准，提高叶酸检测准确率的需求也日益紧迫。目前美国疾病控制中心(CDC)、美国国家标准与技术研究院和美国农业部等机构已开始这方面的工作。参考文献1MRC Vitamin Study Research Group.Prevention of ne

16、ural tubedefects: results of the Medical Research Council vitaminstudy.Lancet，1991，338:131-137.2Green R, Jacobsen DW. Clinical implications ofhyperhomocysteinemia. In: Bailey LB, ed. Folate in health and disease.New York：Marcel Dekker, 1995.99-102.3Newman EM, Tsai JF.Microbiological analysis of 5 -f

17、ormyltetrahydrofolic acid and other folates using an automatic 96-well reader.Anal Biochem, 1986,154:509-515.4Horne DW ,Patterson D. Lactobacillus casei microbiologicalassay of folic acid derivatives in 96-Well microtiter plates.ClinChem,1988,34:2357-2359.5OBroin S,Kelleher B.Mi crobiological assay

18、on microtitreplates of folate in serum and red cells. J Clin Pathol,1992,45:344-347.6OBroin SD,Kelleher BP, Davare A,et al. Field -studyscreening of blood folate concentrations :specimen stability andfinger-stick sampling. Am J Clin Nutr,1997,66:1398-1405.7Gunter EW,Bowman BA, Caudill SP,et al.Resul

19、ts of aninternational round robin for serum and whole-blood folate. ClinChem,1996,42:1689-1694.8Santhosh-Kumar CR,Deutsch JC,Hassell KL,et al.Quantitation ofred blood cell folates by stable isotope dilution gas chromatography-mass spectrometry utilizing a folate internal standard.AnalBiochem,1995,225:1-9.9Kohashi M,Inoue K,Sotobayashi H,et al.Microdetermina