ANA实验室检测策略与临床意义

1、抗核抗体（ANA）检测与临床应用抗核抗体的定义传统定义：针对细胞核成分的自身抗体的总称。广义定义：针对细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。对ANA的理解不再局限于核成分，而是指核酸和核蛋白抗体的总称ANA的靶抗原分布：细胞核整个细胞，包括细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期蛋白等。ENA：抗可提取核抗原，包括区冲6111,5111,55儿558,5。70和101等六种靶抗原ANA检测的临床意义ANA可见于多种疾病，特别是结缔组织疾病，常作为结缔组织病的诊断、病情判断和疗效观察的指标在非结缔组织病中也可出现阳性。正常人中（特别是老年人）也可出现阳性，但滴度低，并且常表现为igM型高滴度ANA则

2、高度提示自身免疫性疾病目前，ANA检测已成为临床上的一个极重要的自身免疫病的筛查实验。美国风湿学会(ACR)立场声明.2IERICAN C OLLEGE OF RHEUMATOLOGYPOSITION STATTME5TSUBJEC T:hfethodology of Tesuns ret Aritixiucleax AxidbodieFRESENTED BY:Amsc«n CoBege of Rbeumatotogj-FOR DISTRIBUTION TO： Kfexubav of the AmencMi College of RheumatologyMedical Socxocs

3、M«n 暂 d Care OrgauzanonsThird Pty Comers LabocafonecSl'ClARY: The J32xn>3加ocecccxe mnuclear antibody (ANA) a3$iy is ibe gold Bedard for ANA texag with greMcr segttviv than 约 Ixi ph? k a 的oy$ HEp-2 alls have 3P典。口matdy 1(W to 150 pembfe aurwnngens. These cede sre used to detect AN As 号 也

4、c mnm3K>fiTK>TCKCiKe (HD method, in wtixh boA jwircm and titer can be devobed. and io dihy a variety ofanunntigens noc present in multiplex ANA tests. Mjid, cornnrKial labcwtorws and soar baspitol laboratoaes ha、p switched thnr ANA scnxning test to solxi phase unnunoaray，： such as ji inultkx p

5、Utfcxni Th? latter eclxuqiie cm scieen and procex laree volumes of elinicsl spccimau more quxkh, snd at k>3 cost ±an ±e aadjton&l 皿皿nofluo向ence ANA test udns 5zed HEp-2 cells 6 通3oaie. Heve xuuluplex assays can oniy 3 specific automWLec diiecd 岑uma the lixmted number (t)ptc-aDy 8-10

6、) aunantien5 rhM «tc djpUW LaboTMocie: should indicate the nx±od uxd when repomzig ANA recula. HEp-2细胞包含大约100至150种自身抗原其它初筛方法仅具有少量自身抗原(8.10)大约35% SLE患者和IFT-ANA阳性患者在其它初筛实验中为阴性结果LiIFTANA仍然为ANA检测的金标准!医院或商业诊断所应用其它ANA检测方法时，必须要求为临床大夫提供足够的数据证明其它ANA检测方法与IFT比较具有同样或更高的敏感度和特异性.实验室在ANA报告当中必须注明ANA检测方法.A

7、NA筛查：间接免疫荧光法(IFT)-»抗原谱完整(细胞核、细胞浆)一检测ANA的金标准，具有很高的敏感性和特异性f基质组合：HEp-2细胞+灵长类肝HEp-2:筛查不同的自身抗体ANA homogen Nuclear dots Centromere ANA nucleolar Scl-70Sm/RNP SS-A/SS-BNuclear memb. Ribosomes Mitochondria Golgi apparat.LysosomesActin Vimentin慢性炎症性结缔组织病(CICTD)慢性炎症性结缔组织病(CICTD)干燥综合征(SS)系统性硬化症(SSc)Scl 70

8、 and Cenpi(CICTD)ANCA相关性血管炎多肌炎/皮肌炎(PM/DM)Myositis ProfileEUROIMMUN红斑狼疮的特点临床大夫：容易误诊的一类致死性疾病免疫学家：所有免疫系统的要件均参与致病机理产生过程临床发病特点发病率:40/100,000（北欧）;200/100,000（黑人）；250,000（美国）患者寿命:4年/50%(1950);15/80%(当前)；20岁诊断/35岁死亡几率1:6SLE-各器官的表现神经系统受累（30%）皮肤（蝴蝶状皮疹,盘状狼疮;74%）浆膜炎（胸膜炎,心包炎；77%）狼疮肾炎（51%）血液系统受累（贫血等;60%）关节炎（至少2个关

9、节以上受累;96%）CharacteristicAntibodiesdsDNA30-90%Nucleosomes50-95%Sm5-10%RibosomalP-Proteins5-15%抗dsDNA自身抗体检测方法：HFT,Farr法ELISAorBlot抗dsDNA抗体与SLE高度特异性抗体； 70%患者阳性，0.5%正常人或RA患者阳性 滴度与疾病活动性相关，但不适用于所有患者 抗体滴度上升但临床症状不明显的患者，抗体检测后5年内80%患者进入活动期最新版“Autoantibodies”描述Differentassaysystemsarenotalwayscomparable,forthe

10、followingreasons:Thesourceofantigendiffers:DNAmaybefromeukaryoticorprokaryoticorigin,double-strandedorsingle-stranded,polydisperseinsizeorhomogenous,etc.;®Presentationoftheantigentotheantibodydiffers:inRIAsitisgenerallyinsolution,inELISAsitiscoatedtoplastic,intheCLIFTtestitispresentedintactince

11、lls；®Reactionconditionsaredifferent：e.g.duetotheemployedammoniumsulphateprecipitationstepusedintheFarrassay,anti-dsDNAoflowavidityismissedwiththismethod;insecondantibodytechniquessuchasIFTandELISA,thechoiceofconjugatedantibodyisofimportance;often,onlyIgGanti-DNAismeasuredwiththesetechniques.不同实

12、验方法的结果并无可比性：1、抗原来源不同；2、抗原展现形式不同；3、实验体系反应条件不同。EUROIMMUN口一NucleosomeH2BH2ALinkerdsDNA核均质：抗核小体抗体(ANuA)靶抗原：dsDNA组蛋白复合物的构象决定簇方法：iifaELISA,Blot临床意义：SLE,阳性率50-95%(100%specific)抗核小体ELISA:敏感性、特异性、疾病活动度分组n抗核小体阳性|SLE233144(61.8%)|干燥综合症411(2.4%)|皮肌炎/多肌炎401(2.5%)|系统性硬化症331(3.0%)|类风湿/骨关节炎601(1.7%)|强直性脊柱炎200健康对照组3

13、10I特异性22598.2%|今ANuA与疾病的活动性相关性强(SLEDAIscore)SuetaL,ClinImmunol122:115-120,2007euroimmunt0ANuA与狼疮性肾炎StintonetaL,Lupus15:394-400,2007狼疮肾炎是SLE的一种潜在的严重并发症（高达50%）-1.2%需要进行肾移植的患者有狼疮肾炎LNTPLNCON(%)(%)(%)ANuA79189Anti-dsDNA434133LNTP=lupusnephritisrequiringrenaltransplantationLN=biopsyprovenlupusnephritisCON

14、=SLEpatientswithoutnephritis伴有狼疮肾炎的严重SLE的生物标记物Anti-U1-nRNP/SmSLESLESharp-Syndrom(MCTD)AntiU1-RNPCore-Proteine(beialienU-nRNP)：70K“、U1-nRNP-spezi-尸:、C/fischeProteine；A、(nurbeiU1-nRNP)SLE:15-40%MCTD:95-100%U(1-6)-RNSAnti-SmSLE:5-30%Function:Pre-mRNAsplicingANAProfile1ANAProfile3SmSS-BnRNP/SmScl-70Jo-1

15、CENPBhistonesrib.P-prot.ControldsDNAnucleosomesnRNP/SmSmSS-ARo-52SS-BScl-70PM-SclJo-1CENPBPCNAdsDNAnucleosomeshistonesrib.P-prot.AMAM2ControlEUROLINEANA谱 最多18种抗原，增加了RNP亚单位 自动化操作 全自动化结果判读DL1590-1601-8GDL1590-1601-3GDL1590-1601-5G实验结果的解释（ANA谱）：抗nRNP/Sm和Sm抗体抗nRNP/Sm抗体抗Sm抗体结果解释.nRNP:-Sm:-阴性+nRNP:?Sm:+SL

16、E+一nRNP:+Sm:-SLE或MCTD+结果不可靠无抗核糖体P蛋白抗体抗原:核糖体60s亚单位的3个蛋白：P05P15P2.在竣基末端有相同的免疫反应表位。核糖体P抗原的五聚体复合物。accordingto:MahleretalrJMolMed,2003EUROIMMUNCohortnAnti-ribPpositiveSLE36034(9.4%)Othercollagenoses*790%Healthyblooddonors2060%*systemicsclerosis,Sjogren'ssyndrome,dermato-/polymyositis玲对SLE100%特异Cohort

17、nAnti-ribPpositiveSLE18510(5.4%)|MCTD210SS550SSc660RA890HD1000Specificity310100%|靶抗原:表达为细胞周期依赖性(S期)三聚体(36kDa),是DNA多聚酶的辅因子并参与DNA修复调控检测：IIFT,Blot临床意义：SLE高特异性(阳性率37%),与肾脏和CNS及血小板减少相关慢性炎症性结缔组织病(CICTD)干燥综合症(SS)系统性硬化症(SSc)Scl 70 and Cenpi(CICTD)ANCA相关性血管炎多肌炎/皮肌炎(PM/DM)Myositis ProfileEUROIMMUN干燥综合征(Sjdgre

18、rTsSyndrome)外分泌腺受累的自身免疫疾病 症状： 口腔干燥 唾液及眼泪减少 腮腺肿胀 胰腺外分泌腺分泌不足干燥综合征CharacteristicAntibodiesSS-A(60kDa)40-95%SS-B(47kDa)40-95%抗SSA/SSB抗体SS-AAntigenRNA+SS-A(60kDa)+Ro-52RNA+SS-A(60kDa)Boireetal.,1995:-Ro-52抗体不与SS-A抗原结合纯化的SS-A抗原不包含Ro-52SS-A(Ro-60),Ro-52andSS-BAnti-Ro-52(52kDa)非特异功能：调控RNA翻译Anti-SS-A(60kDa)S

19、jogrenSyndr.:40-95%SLE:20-60%neonatalLE:96%功能:RNA聚合酶III辅助蛋白5247kDaCAUGi60kDagupppGCUUUUAnti-SS-BSjogrenSyndr.:40-95%SLE:10-20%neonatalLE:78%Anti-Ro52:不同组别中均可出现Anti-Ro52:风湿性疾病中的阳性率疾病干燥综合症系统性硬化症肌炎SLEMCTDRA2621021165Anti-Ro-52 positive81 %28%31 %38%19%5%=AntiRo52在干燥综合症中阳性率较高，但没有疾病特异性Anti-Ro52:肝脏疾病中的阳性率

20、=Anti-Ro52没有疾病特异性抗SS-A(60kDa)和抗Ro-52总是分开检测!nRNP/SmSmSS-A Ro-52SS-BScl-70PM-SclJo-1CENPBPCNAdsDNA nucleosomeshistonesrib. P-prot.AMA M2-I 二三二l一rjm nsMNHBEUROLINE ANA Profile 3SS-ARo-52Control结论- 天然SS-A=RNA+SS-A60kDa蛋白质- SS-A60和Ro-52抗原的混合包被会降低SSA抗体的疾病特异性- 欧蒙产品始终分别检测SS-A60和Ro52!SS-ARo-52EUROLINEANAProf

21、ile3EUROIMMUN慢性炎症性结缔组织病(CICTD)系统性红斑狼疮(SLE)dsDNA干燥综合症(SS)(CICTD)ANCA相关性血管炎系统性硬化症(SSc)Scl70andCenpB多肌炎/皮肌炎(PM/DM)Myositis ProfileEUROIMMUN系统性硬化症（SSc）血管与结缔组织受累的自身免疫疾病症状：-指端硬化（thin,scleroticfingers）爪型手面具脸（嘴周边出现皱纹,嘴唇变薄）毛细血管扩张（表面血管永久性扩张）表皮钙质沉着（血管壁与皮肤钙化）毛细血管扩张指端硬化，爪型手皮肤钙质沉着期分类自身抗体及阳性率局限型纤维化仅局限于指端、胳膊和脸部；纤维化

22、发生数年前已经出现明显雷诺现象;常伴肺动脉高压；着丝点抗体50-90%弥散型病程发展较快;大面积皮肤受累；至少累及一种以上内脏器官;Scl-丁口抗体30%实验室结果和临床数据的联合分析，有助于降低疾病诊断的模糊性,同时为未来研究硬化症提供基础。系统性硬化症(SSc)CharacteristicAntibodiesCentromeres12-43%Scl-7018-30%Fibrillarin6-8%RNAPolymerases2-23%PM-Scl(Polymyositis-Overlap)1-16%抗着丝点抗体HEp-2-Cells/PrimateliverCENPA/C CENPBChro

23、matid 1INCENPChromatid 2Kinetochor(rudiment of the achromatic Egure spindle)检测方法：IIFT, ELISA, Blot抗着丝点抗体靶抗原：着丝点DNA联合蛋白:CENP(A,B,C,D)临床意义：局限性PSS(CREST-Syndrome):经常出现在：硬皮病PBC重叠综合症抗Scl70抗体HEp-2-Cells/Primateliver:细胞核仁：Scl-70Anti-Scl-70靶抗原：DNA拓扑异构酶I(100kDa)DNA双螺旋复制和转录Scl-70检测方法：UFA, ELISA, Blot临床意义:Scl-

24、70；弥散性硬皮病的诊断标志(50-75%).预后：较着丝点阳性的患者病情更严重。Anti-CenpB与Anti-Scl-70Systemicsclerosisn=295Anti-Scl-70positivenegativeAnti-CenpBpositive1106negative66122n59%系统性硬化症患者分别出现抗着丝点抗体或抗Scl70抗体阳性抗RNA聚合酶I抗体HEp-2-Cells/Primateliver抗原纤维蛋白抗体HEp-2-Cells/Primateliver:抗PM-Scl抗体HEp-2-Cells/Primateliver抗PM-Scl抗体靶抗原：PM-Scl:

25、11到16个多肽复合物在rRNA和一些UsnRNAs剪接中起作用(PM-Scl-100,PM-Scl-75)检测方法：IIFT,ELISA,Blot临床意义：重叠综合症的诊断标志，表现为肌炎和硬皮病症状(阳性率50-70%).Scl-70 -CENP A -CENP B -RP11 (RNAP-III) RP155 (RNAP-III) -Fibrillarin -NOR-90 1ThZTo PM-ScIWO PM-Scl75 .Ku -PDGFR -Ro-52 -Control - 透DL 1532-1601 GEUROLINE系统性硬化症谱 一个实验膜条包括13种高特异性纯化抗原 系统性硬

26、化症(SSc)血清学诊断 EUROBIotMaster自动化操作 EUROLineScan软件全自动结果判读EUROIMMUNW系统性硬化症相关抗体MeyeretaL,7thCongressonAutoimmunityinLjubljana,May2010患者血清：129份SSc血清和202份对照似清50PM/DM,50SLE,42RA,60HDAntigenSensitivitySpecificityScl-7065%99%CENPA11%99%CENPB13%99%RP115%100%RP1557%100%Fibrillarin2%100%NOR-904%99%Th/To6%98%PM-S

27、cl1007%99%PM-Scl7512%98%Ku6%99%PDGFR1%100%所有抗原的血清命中率为：85.3%.EUROIMMUN口一Studies,Flyers,PublicationsPrevalence of autoantibodies agaln&t PM/Scl75 andPM/Scl100 in systemic 5clerosisK. A. Ana.M. W. T. SciwptH. L KwncrgwiS D, fink1.W 债hlumtw，。*. C. Bruxf. K. U«r«r'. F. and C. fCwmabavte

28、n*AntibodiesagainstPM/Sc1-75andPM/Scl-100areindependentmarkersfordifferentsubsetsofsystemicsclerosispatients.K.Hanke,C.Bruckner,C.Dahnrich,D.Huscher,L.Komorowski,W.Meyer,A.Janssen,M.Backhaus,M.Becker,A.Kill,K.Egerer,G.R.Burmester,F.Hiepe,W.SchlumbergerandG.RiemekastenArthritisResearch&Therapy,20

29、09:11Diagnosticvalueofanti-topoisomeraseIantibodiesinalargemonocentriccohortHankeK,DahnrichC,BrucknerCS,HuscherD,BeckerM,JansenA,MeyerW,EgererK,HiepeF,BurmesterG,SchlumbergerW,RiemekastenG.ArthritisResearch&Therapy(inpress).慢性炎症性结缔组织病(CICTD)皮肤与肌肉受累的自身免疫疾病症状：-肌肉疼痛/肌无力(e.g.肩膀/骨盆)皮肤症状：红斑膝盖/手指关节处皮肤异

30、变皮肤褪色CharacteristicAntibodiesJo-125-35%Mi-2(esp.inDM)15-30%PM-Scl(PSS-Overlap)8%PL-73-6%PL-123%抗Jo-1抗体HEp-2-cells/Primateliver胞浆颗粒:Anti-Jo-1靶抗原：Jo-1（组胺酰tRNA合成酶）检测方法：UFA,ELISA,Blot临床意义：对多肌炎具有高度特异性（阳性率25-35%）Jo1：病情严重的标志。常与肺纤维化有关（70%）氨酰基-tRNA-合成酶mRNARibosome(40 S)氨酰基-tRNA合成酶Jo-1:组氨酰LtRNA合成酶PL-7:苏氨酰基“RN

31、A合成酶PL12:丙氨酰tRNA合成酶0J:异亮氨酸tRNA合成酶EJ:甘氨酰tRNA合成酶细胞核颗粒:Anti-Mi-2靶抗原：多组分系统；与组蛋白乙酰基转移酶和核小体重塑活性有关的主要抗原（218kDa）临床意义：肌炎5-15%（主要是皮肌炎）抗Ku抗体HEp-2-Cells/Primateliver细胞核颗粒：Anti-Ku(p70/p80)靶抗原:DNA结合的非组蛋白和DNA依赖的蛋白酶异源二聚体分析方法：IIFA3Blot临床意义：PM/Scl重叠综合症30-55%SLE5-10%EUROLINE肌炎相关抗原 一个膜条上包括7或11种高度纯化抗原(痂PM-Scl,SRP,EJ,OJ)

32、 DM和PM及原发性肌炎的血清学诊断EUROBIotMaster自动化操作EUROLineScan全自动化判读结果EUROLINE肌炎相关抗原Ghirardelloetal,AutoimmunRev,2009患者血清:208份肌炎患者血清214份对照血清50 HD, 65 SLE, 34 SSc, 21 SjS,13非自身免疫性肌病，23 CTD-相关性肌炎，8关节病Anti-PrevalenceSpecificityMi-24%98%5%95%pm-schoo4%100%Jo-121 %100%PL-7 or PL-124%100%所有抗原的血清学命中率：37%.Studies,Flyers

33、,PublicationsEUROIMMUNMcdizinischcLabordlagnostikaAGEUROLINEProfilesMyositisAssociatedAntigensAntigen combinationExamplesofincubatedstripsMyositisassoc.autoantibodiesKuPMWOOJO-1PL-7PL12fts.52ConerolDI1530-1W1GMi-2-KUPMSCH8PM"SCIBJo-1SRPPt-7R.-12£JRO-52ContrclDC15X-W1-3GWEE2,2，100Ku?97KPMRV

34、3八100*g，12KWKfV73%100%Da”00k3”沁cid.U»cdwirwaaltecbtat»*<mayevaq«»«ler,anu«R4Mif>Wlarvtrrc««:«patcnvT3wttnl»«r«wtilMnt«n(«»Wn吃,44CUM*.Km匕oc二PMWWat100KXI1K».K7o,PS1CB».Ghr<r4H<>ei«l女，degk*!f”痴c4Set

35、atty,erlatMTMcrafCcy-cnAuw«nms»y.心4J»>«2S&senHjt,rttvXM&*«*».214Kfc.tetalEcmrrfMtfaxW372.皿.Sp«e«kESAPao1”1WKOJ18%PM-Sd«0KKJW*9y。Cn>nSlX切.*»Ee»o«rvlofTMs«tcn».son卬PM*W：f«iiw«k,Stno.J*Qcr4Useofacommercialline

36、blotassayasascreeningtestforautoantibodiesininflammatorymyopathiesJ.Ronnelid,S.BarbassoHelmers,H.Storfors,K.Grip,L.Ronnblom,K.Franck-Larsson,G.Nordmark,LE.LundbergAutoimmunityReviews2009Mar11TechnicaldataApp<iQlK>nsDot&rmtnalianofauloKibodos叱agmyoxcnasaoatodantigvisfortbuseralogKaidiagnosi

37、sofdermatixnyxwito.polymyosit*,idiopathicrn>putis,nnthyEhoUcosyndromsandovorbppingsmdromeaAntigensubs:rxasManbranodipsprintndwithindividuWInasofptrAod.bio6smical,characteriradMobtEachandoonitcooudocioasopsnwntranodiip.ptuvidiojoptimJotndonc/ofantbody傥阳Snfor2由proteinSampladiutionSonxnorplasma：1:501insamp4abuffarTottpnxoduro30min/30min/笫minRoomiq<ujqgcuhj.Aiitcmanonc<rticr«CompriWe*imallcomnwc3DkxproowirwsyswrrsComputdfrbflsfidovaiuaticno,rsu-w*EUftOLinaSoinprogramKilformolwnKimbranostrips.KrsindidoallnaefiisaryregentsRJOOt