蛋白质组学与技术第二讲

1、蛋白质组学与分析技术蛋白质组学与分析技术邱德文邱德文中国农科院植物保护研究所中国农科院植物保护研究所第一章第一章 蛋白质组学的概念蛋白质组学的概念v 蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（组（proteome）一词，是指）一词，是指“一种基因组所表达的全套蛋一种基因组所表达的全套蛋白质白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。质。v 对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质；其目的是从整体的角度分析细胞内

2、动态变或几个蛋白质；其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。规律。978 Cell 136, March 6, 2009蛋白质基因互作、蛋白质受体、信号传导、蛋白质基因互作、蛋白质受体、信号传导、调控代谢网络、作用机理、代谢途径调控代谢网络、作用机理、代谢途径蛋白质的分离与纯化蛋白质的分离与纯化蛋白质研究流程蛋白质研究流程v 蛋白质的分离、纯化与鉴定v 功能蛋白蛋白分离（硫酸氨、乙醇沉淀、离心、

3、获得功能粗蛋白制品纯化（液相色谱、蛋白质分析制备仪、双向电泳、液质联仪氨基酸测序基因克隆蛋白质药物作用于植物的蛋白表达谱药物于植物的相互作用。 蛋白质的分子量蛋白质的分子量 一般在一万至一百万道尔顿之间一般在一万至一百万道尔顿之间 1道尔顿道尔顿1C12绝对质量绝对质量/12 1.6610-27千克千克蛋白质分子的大小 蛋白质含有酸蛋白质含有酸/ /碱碱AAAA残基具有两性残基具有两性 碱碱/ /酸越大酸越大pI pI 越大越大vpI通常在通常在 6.0 左右左右蛋白质的两性电离及等电点蛋白质分离纯化的一般原则总目标：增加制品纯度或比活总目标：增加制品纯度或比活1.1.前处理：因动前处理：因动

4、/ /植物植物/ /细菌而异细菌而异2.2.粗分级分离：采用盐析粗分级分离：采用盐析/ /等电点沉淀等电点沉淀/ /有有机溶剂分级分离等方法机溶剂分级分离等方法3.3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等层析、吸附层析以及亲和层析等4.4.结晶结晶样品制备原则样品制备原则v尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失v细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的降解v样品裂解液应该新鲜制备、并且分装冻存于-80C,不要反复冻融已制备好的样品v通过超速离心清除所有的杂质v加入尿素之后加温不要超过37C,

5、防止氨甲酰化而修饰蛋白从生物样品抽提蛋白质从生物样品抽提蛋白质v去污裂解：溶解细胞膜裂解细胞如SDSv还原剂：用于还原二硫键或防止蛋白质氧化如巯基乙醇、硫脲v变性剂：用于改变溶液离子强度和PH，破坏蛋白质的二级和三级结构v酶裂解：用酶来消化细胞器如溶菌酶、纤维素酶、果胶酶等v渗透裂解：用低渗溶液悬浮细胞v冻融裂解：用液氮迅速冷冻细胞，随后在37C融化，反复几次剧烈的蛋白裂解剧烈的蛋白裂解v超声裂解法：通过超声波切应力来裂解细胞，在剧烈的搅拌状态下会产生剪切效果v弗氏压碎器：在高压下迫使细胞穿过小孔径产生剪切力裂解细胞v研磨法：组织和细胞常冻存于液氮中，研磨成粉状v机械匀浆法：将组织切成小片、匀

6、浆、过滤或离心获得裂解液v玻璃珠匀浆法：剧烈震荡的玻璃珠可以打破细胞壁，释放细胞内容物蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解v 苯甲基磺酰氟PMSF: 不可逆抑制剂v AEBSF：灭活丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶v 金属蛋白酶抑制剂乙二 胺四乙酸（EDTA）、乙二醇双四乙酸(EGTA)v 肽蛋白酶抑制剂：亮以酶肽，抑制丝氨酸、半胱氨酸蛋白酶活性，为蛋白酶抑制剂A抑制酸性蛋白酶活性，抑蛋白酶肽抑制丝氨酸蛋白酶，本丁抑制素抑制氨基蛋白酶。v 甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮（TLCK）、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）: 不可逆抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶。v Benzamidine: 抑制丝氨酸蛋

7、白酶蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化方法根据分子大小不同的纯化方法根据分子大小不同的纯化方法 透析和超过滤透析和超过滤v利用蛋白质分子不能透过半透膜将其利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 v 与小分子物质分开与小分子物质分开v半透膜为玻璃纸或纤维素材料半透膜为玻璃纸或纤维素材料利用溶解度差别的纯化方法利用溶解度差别的纯化方法 1. 1.等电点沉淀等电点沉淀 调整溶液调整溶液pH 不同蛋白在各自不同蛋白在各自 pI处依次沉淀处依次沉淀 2.2.盐溶和盐析盐溶和盐析 3.有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法 降低介电常数降低介电常数 争夺水化膜争夺水化膜蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（一）胶体性

8、质（一）胶体性质（colloidal system）胶体溶液的特点：胶体溶液的特点：w分子直径在分子直径在1-100 nm1-100 nm内内w溶于水溶于水w不易聚集沉淀不易聚集沉淀大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀 蛋白蛋白从胶体溶液中析出从胶体溶液中析出 可逆沉淀：可逆沉淀： 温和条件，改变溶液温和条件，改变溶液pH或或蛋白所蛋白所带电荷带电荷 蛋白蛋白结构和性质没有变化结构和性质没有变化 适当条件下可重新溶解适当条件下可重新溶解 非变性沉淀非变性沉淀vpI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等 不

9、可逆沉淀不可逆沉淀v强烈沉淀条件强烈沉淀条件v破坏破坏Pr胶体溶液稳定性胶体溶液稳定性v也破坏也破坏Pr结构和性质结构和性质v沉淀不能再重新溶解沉淀不能再重新溶解变性沉淀变性沉淀v如加热沉淀、强酸如加热沉淀、强酸/ /碱沉淀、重金属盐碱沉淀、重金属盐 和生物碱沉淀等和生物碱沉淀等蛋白质分离的常用技术蛋白质分离的常用技术v 1、沉淀，、沉淀， v 2、电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场、电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶中能向电场的正极或负极移动。根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。电泳等

10、。 v 3、透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。、透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。 v 4、层析：、层析： v a.离子交换层析，利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定离子交换层析，利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定PH时，时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。如阴离子交换层析，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。如阴离子交换层析，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。 v b.分子筛，又称凝胶过滤。小分子蛋白质进入孔内，滞留时间长，分子筛，又称凝胶过滤。小分子蛋白质进入

11、孔内，滞留时间长，大分子蛋白质不能同时入孔内而径直流出。大分子蛋白质不能同时入孔内而径直流出。 v 5、超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的、超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。分子量。不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。 沉淀法沉淀法v 1、盐析法、盐析法 v 盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷

12、逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。分子间互相凝聚并从溶液中析出。 v 2、有机溶剂沉淀法、有机溶剂沉淀法 v 有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：其一、与盐溶液一样有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：其一、与盐溶液一样具有脱水作用；其二、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性具有脱水作用；其二、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。减小。 v 3、蛋白质沉淀剂、蛋白质沉淀剂 v 蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用，常见的有碱性蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用，常见

13、的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。蛋白质、凝集素和重金属等。 v 4、聚乙二醇沉淀作用、聚乙二醇沉淀作用 v 聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。发生沉淀作用。 v 5、选择性沉淀法、选择性沉淀法 v 根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点，根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点，用适当的选择性沉淀法，即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成用适当的选择性沉淀法，即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中，从而达到纯化有效成分的目的。分则存在于溶液中，从而达到纯化

14、有效成分的目的。 蛋白沉淀步骤蛋白沉淀步骤v硫酸铵沉淀（盐析）：高盐溶液中蛋白质聚合而沉淀vTCA沉淀（三氯醋酸沉淀）：TCA 10%-20%，蛋白质可冰上沉淀，用丙酮和乙酸清洗沉淀。去除TCAv丙酮沉淀：3倍体积的冰丙酮，蛋白在-20度沉淀，离心沉淀蛋白，丙酮通过空气或冻干去除v在丙酮中用TCA三氯醋酸沉淀：两者联合使用更有效，10%的TCA在丙酮中重悬裂解样品溶液v用苯酚提取，随后在甲醇中醋酸铵沉淀：蛋白质被提取到饱和酚中，在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白，丙酮清洗血液透析血液透析小分子溶出小分子被带出小分子被带出透析机透析机透析液透析液加加压压血液血液透析透析只用于除盐类和小分子杂质只用

15、于除盐类和小分子杂质 完整蛋白质的分离完整蛋白质的分离v1D-SDS-PAGEv2D-SDS-PAGEvIEF(制备等电聚焦)vHPLCv离子交换或亲和层析电泳法电泳法v类型：1、区带电泳 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。 凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电泳、等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电泳。 2、自由界面电泳：支持物为溶液，很少用。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳v通过丙烯酰胺单体和N，N，-甲叉双丙烯酰胺按一定比率混合，在有引发剂和增速剂存在下聚合形成交叉网状结构，丙烯酰胺单体聚合生成长链聚

16、合物，甲叉双丙烯酰胺的双功能和链末端的自由功能基团反应，发生交联，形成网状结构v等电聚焦凝胶，按等电点不同分离蛋白质，SDS-PAGE按相对分子质量大小分离蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳v蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。加入SDS（十二烷基磺酸钠）和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与原来所带电荷、分子形状无关。SDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。巯基乙醇打开二硫键，因此使蛋白质分子处于伸展状态。此时SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合物，大约每两个氨基酸残基结合一个SDS分子。等电聚焦（等电

17、聚焦（Isoelectric focusing） v(1)以不同蛋白质的等电点的差异分离。(2)凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质。(3)载体两性电解质： 一维等电聚焦电泳一维等电聚焦电泳v蛋白质在不同PH值的溶液中带电荷情况是不同的，在低的PH条件下，蛋白质静电荷为正，在高PH条件下静电荷为负，在某一PH的溶液中，蛋白质的静电荷为零，则此PH值为该蛋白的等电点v蛋白质等电点取决与氨基酸的组成，是一个物理化学常数v如果外加一个电场，蛋白质会在电场作用下分别向正极和负极漂移，当达到等电点位置时，蛋白不带电，就不在漂移，这就是等电聚焦电泳的基本原理双向凝胶电泳（双向凝胶电泳（2-DE）原理原理v

18、Smithies和Poulik(1956 )最早引入二维电泳技术，OFarrell（1975）根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离v二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质 双向电泳原理简明双向电泳原理简明, ,第一向进行等电第一向进行等电聚焦聚焦, ,蛋白质沿梯度分离至各自的等蛋白质沿梯度分离至各自的等电点电点, ,随后随后, ,再沿垂直的方向进行分子量再沿垂直的方向进行分子量的分离的分离. . 目前目前, ,随

19、着技术的飞速发展随着技术的飞速发展, ,已已能分离出能分离出1000010000个斑点个斑点( () )。 银染已成为一种检测银染已成为一种检测2- D2- D的流行方法的流行方法, ,可检测可检测少到少到2 25 5的蛋白的蛋白, ,因此较考马斯亮蓝因此较考马斯亮蓝- 250- 250敏敏感感. . 多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色. . 另有一种改良的另有一种改良的2- 2- ( (差异凝胶电泳差异凝胶电泳),),即应即应用两种不同的染料荧光标记两个样品用两种不同的染料荧光标记两个样品, ,使在同一凝胶使在同一凝胶上电泳后的凝胶图象为两个上电泳后的凝胶图象为两个

20、, ,避免了几种避免了几种2 -2 -的的比较比较, ,可在纳克级进行检测可在纳克级进行检测. . 等电聚焦电泳等电聚焦电泳双向电泳双向电泳1D-SDS-PAGE2D-SDS-PAGE第一向 IEF电泳染色第二向 SDS-PAGE电泳图像采集和分析蛋白斑点的切取样品制备实验样品的制备原则实验样品的制备原则v应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。v防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。v防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。v完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。v尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研

21、究蛋白的可检测性。图象分析技术图象分析技术“满天星满天星”式的式的2 图谱分析不能依靠本能的直觉图谱分析不能依靠本能的直觉,每一每一个图象上斑点的上调、下调及出现、消失个图象上斑点的上调、下调及出现、消失,都可能在生理和病都可能在生理和病理状态下产生理状态下产生,必须依靠计算机为基础的数据处理必须依靠计算机为基础的数据处理,进行定量分进行定量分析析 在一系列高质量的在一系列高质量的2 凝胶产生凝胶产生(低背景染色低背景染色,高度的重高度的重复性复性)的前提下的前提下,图象分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比图象分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建。和数据库构建。 采集图象通常所用的

22、系统是电荷耦合采集图象通常所用的系统是电荷耦合(charge coupled device) 照相机照相机;激光密度仪激光密度仪(laser densitometers)和和Phospho或或Fluoro-imagers,对图象进行数字化对图象进行数字化 并成为以象素并成为以象素(pixels)为基础的空间和网格为基础的空间和网格 其次其次,在图象灰度水平上过滤和变在图象灰度水平上过滤和变形形,进行图象加工进行图象加工,以进行斑点检测以进行斑点检测. 目前双向凝胶电泳一般只能分辨到目前双向凝胶电泳一般只能分辨到1000-30001000-3000个个蛋白质点蛋白质点(SPOT),(SPOT),

23、而一个细胞系可以表达上万个基因而一个细胞系可以表达上万个基因, ,加上蛋白质加工修饰的多样性加上蛋白质加工修饰的多样性, ,一个样品中的蛋白种类一个样品中的蛋白种类可达可达10106 6种。种。 对于一些低拷贝蛋白对于一些低拷贝蛋白, ,通常先将蛋白粗提液通过亲通常先将蛋白粗提液通过亲和柱纯化和柱纯化, ,再由一维或二维电泳分离。单向电泳的优点再由一维或二维电泳分离。单向电泳的优点在于几乎所有蛋白质均溶于在于几乎所有蛋白质均溶于, ,分子量在分子量在10000-10000-300000300000范围内均能有效分离范围内均能有效分离, ,极酸、极碱蛋白极易检出。极酸、极碱蛋白极易检出。 双向凝

24、胶电泳原理简明双向凝胶电泳原理简明, ,第一向进行等电聚焦第一向进行等电聚焦, ,蛋白蛋白质沿梯度分离质沿梯度分离, ,至各自的等电点至各自的等电点; ;随后随后, ,在沿垂直的在沿垂直的方向进行分子量的分离。方向进行分子量的分离。蛋白质电泳图像分析蛋白质电泳图像分析v电泳凝胶后图象进行备份保存，从而以数字化图象形式存储下来，尽量完整的保留定性和定量信息以进一步分析，如总蛋白的点数，蛋白点的表达丰度的电量变化，蛋白点的缺失，利用双向电泳凝胶分析软件进行分析二维凝胶电泳图像采集二维凝胶电泳图像采集v图象分析基本上依赖与各个蛋白质点的光密度值相对大小v图象采集质量的因素包括系统的分辨率、灵敏度、图象对比度和明亮度v常见的可见光扫描仪、荧光、化学发光和磷屏扫描仪二维凝胶电泳图像分析二维凝胶电泳图像分析v蛋白质点数的统计、蛋白质点的定位、编号和相对丰度分析v软件可自动检测出完整的蛋白质点，图象分析软件有：melanie II&3、PDQuset 6.0、ImageMaster 2D Elite 3.10、Phoretix 2D 等v蛋白质点检测、背景消减、归一化处理、蛋白质点匹配结果输出结果输出v双向电泳图象分析会产生大量的数据，以表格的形式输出或粘贴到Micro