巨噬细胞IL-10和TNF-α在人慢性牙周炎牙龈组织中表达的研究医学专业

1、题名（中英对照）：巨噬细胞IL-10和TNF-在人慢性牙周炎牙龈组织中表达的研究IL-10 and TNF- expression on macrophage in gingival tissue of human chronic periodontiti中文摘要背景及目的：牙周病（periodontitis diseases）是发生于牙齿周围组织的炎症性疾病，为口腔两大疾病之一，是导致牙齿脱落的主要原因。牙周炎被认为是多因素疾病，目前认为牙周病的始动因子为牙菌斑生物膜。牙周致病菌不仅对牙周组织造成直接损伤，还可以通过刺激、调控宿主的免疫防御系统间接损伤牙周组织，目前认为这种免疫炎症反应对牙周

2、组织的损伤远超过了微生物对组织的直接作用。巨噬细胞（microphage, M）是机体防御反应的第一道防线，是固有免疫的重要组成部分，能对细菌或异物进行识别、吞噬以及清除。IL-10（interleukin-10）是一种多功能细胞因子，可抑制T淋巴细胞功能以及单核/巨噬细胞的活化和效应作用，对不同类型的造血细胞也发挥不同的作用。IL-10主要由Th2细胞产生，能有效抑制IL-1、IL-1、IL-6、IL-12、GM-CSF、TNF（tumor necrosis factor）等Th1细胞因子，从而发挥抑炎作用。TNF-主要由活化的M和Th1细胞分泌的细胞因子，作用于血管内皮细胞，诱导其合成黏附

3、因子，进而使白细胞尤其是中性粒细胞（neutrophil）以及单核细胞（monocytes）向血管内皮细胞（endothelial cells， EC）黏附以及向组织内游出，从而发挥抗炎的作用。IL-10、TNF-参与了Th细胞免疫应答的调控过程。目前有关M表达IL-10、TNF-在慢性牙周炎领域尚未见报道。 本研究通过观察慢性牙周炎的牙龈组织中M表达IL-10、TNF-的情况，分析M分泌的IL-10、TNF-在牙周感染中的作用及其作用机制。研究结果将对后续以M IL-10、TNF-为靶点研究慢性牙周炎的免疫预防提供分子理论基础和实验依据。 方法：选取自愿接受研究的80名慢性牙周炎患者，依据慢

4、性牙周炎的分类标准分为4组：1)正常对照组20例；2)轻度慢性牙周炎组20例；3)中度慢性牙周炎组20例；4)重度慢性牙周炎组20例。牙龈标本采用10 %中性福尔马林固定液浸泡处理，浸泡时间超过48 h，制作颊舌向5m的牙龈组织切片。H&E染色后光学显微镜下观察其组织学变化。采用免疫组织化学技术（immunohistochemistry, IHC)，在光学显微镜下观察组织中M（CD14+）募集以及CD14+、IL-10+、TNF-+ 的表达，并计算出平均阳性细胞率；然后采用免疫荧光双染色（double immunofluorescence, DIF）进行染色，在荧光显微镜及共聚焦显微镜

5、下观察牙龈组织标本中的CD14+-IL-10+及CD14+-TNF-+，并计算CD14+-IL-10+、CD14+-TNF-+的细胞密度(cells/mm2)。采取统计学软件SPSS 13.0对计算所得数据作分析和处理，采用Wilcoxon符号秩检验、Kruskal-Wallis H检验、Nemenyi法检验、单因素方差分析(one-way ANOVA)和Pearson相关分析，P0.05时认为差异有统计学意义。结果：1、组织学观察结果1）与正常对照组对比，三组慢性牙周炎患者的牙龈组织中炎症细胞均显著增加 (P0.01)；2）随着牙周炎病变程度的加重，牙龈组织中炎症细胞显著增加 (P0.01)

6、。2、免疫组织化学染色结果1）与正常组对比，三组慢性牙周炎患者的CD14平均阳性细胞率均显著上升(P0.01）；2）与正常组对比，三组慢性牙周炎患者的IL-10平均阳性细胞率表达水平均显著下降 (P0.01)；3）与正常组对比，三组慢性牙周炎患者的TNF-平均阳性细胞率表达水平均显著上升 (P0.01)。3、免疫荧光双染色结果1）与正常组对比，三组慢性牙周炎患者的CD14+-IL-10+细胞密度均显著下降(P0.01)；2）与正常组对比，三组慢性牙周炎患者CD14+-TNF-+细胞密度均显著上升(P0.01)。4、慢性牙周炎的病变程度与M平均阳性细胞率、CD14+-IL-10+细胞以及CD14

7、+-TNF-+细胞三者之间的相关性经Pearson相关分析，结果显示：1）慢性牙周炎的病变程度与各组M平均阳性细胞率、CD14+-TNF-+细胞密度之间的相关性为显著的正相关的关系；2）慢性牙周炎的病变程度与CD14+-IL-10+细胞密度之间的相关性为显著的负相关的关系。结论： 1、M平均阳性细胞率随着牙周炎的严重程度的加重而显著上升。 2、CD14+-TNF-+细胞密度随着牙周炎的严重程度的加重而显著上升。 3、CD14+-IL-10+细胞密度随着牙周炎的严重程度的加重而显著下降。 在牙周炎的过程中，牙龈组织中的M参与了牙周的抗感染免疫应答；M分泌的IL-10、TNF-在慢性牙周炎过程中，

8、通过抑炎和抗炎作用在免疫调控中可能起到关键性因子的作用。关键词：慢性牙周炎；巨噬细胞；IL-10；TNF-Abstract Background and objectivePeriodontitis are inflammatory diseases that occur in periodontal tissues, leading to the loss of teeth. Periodontitis is considered to be a multifactorial disease, and it is currently believed that the plaque biof

9、ilm is a factor in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontal pathogens not only cause direct damage to the periodontal tissues, but also indirectly damage the periodontal tissues by stimulating and regulating the host's immune defense system. At present, it is believed that the damage

10、 of the periodontal tissue by this immune and inflammatory reaction far exceeds the direct effect of the microorganism on the tissue. Although much research has been conducted on the immune mechanisms of periodontal disease, the type of immune cells involved in periodontal disease and the immune mec

11、hanisms has not been elucidated.M (Macrophage) is the first line of defense of the body's defense response which is an important component of innate immunity. It can recognize, phagocytose, and remove bacteria or foreign bodies. IL-10 (interleukin-10) is a multifunctional cytokine that inhibits

12、T lymphocyte function and the activation of monocytes/macrop-ages. There are also differences in the effects of different types of hematopoietic cells. IL-10 is mainly produced by Th2 cells and can effectively inhibit IL-1, IL-1, IL-6, IL-12, GM-CSF, TNF (tumor necrosis factor) and other cytokines,

13、thus playing an anti-inflammatory role. TNF- is mainly composed of activation of M and Th1 cells secrete cytokine secretion in vascular endothelial cells, inducing the synthesis adhesion factor, thus makes leucocyte especially neutrophils and mononuclear cells, monocytes to vascular endothelial cell

14、s(EC) adhesion and swam out to the organization, so as to play the role of anti-inflammatory. Il-10 and TNF- were involved in the regulation of Th cell immune response. At present, there is no report on the expression of Il-10 and TNF- M in chronic periodontitis. In this study, We observed the expre

15、ssion of Il-10 and TNF- M in chronic periodontitis gingival tissue,and analyzed the role and mechanism of IL-10 and TNF- in periodontal infection. The results of the study will provide theoretical basis and experimental basis for the follow-up study on the immune control of chronic periodontitis, wh

16、ich is targeted by M IL-10 and M TNF-.Methods Eighty patients with chronic periodontitis who volunteered to receive the study were divided into four groups according to the classification criteria of chronic periodontitis: 1)20 patients in the normal control group; 2)20 patients in the mild chronic

17、periodontitis; 3)20 patients in the moderate chronic periodontitis; 4)20 patients in the severe chronic periodontitis. Gingival specimens were soaked in 10% neutral formalin and soaked for more than 48 hours, and the buccal tongue was made to the gingival tissue of 5m. After H&E staining, histol

18、ogical changes were observed under a light microscope. Immunohistochemical staining was used to observe the recruitment of M (CD14+) and the expression of CD14+, IL-10+ and TNF-+ in the tissue under an optical microscope, and the average positive cell rate was calculated. The CD14+-IL-10+ and CD14+-

19、TNF-+ in the tissue samples of the gingival tissue were observed under fluorescence microscope and confocal microscopy, and the density of CD14+-IL-10+ and CD14+-TNF-+ (cells/mm2) was calculated.The statistical software SPSS 13.0 was used to analyze and deal with the computed data, using Wilcoxon sy

20、mbol rank test, Kruskal-wallis H test, Nemenyi method test, Single factor variance analysis (one-way ANOVA) and Pearson correlation analysis, P0.05 the difference was regard as statistically significant.Results1. Histological observations1) Compared to the normal control group, inflammatory cells in

21、 the gingival tissues of three groups of chronic periodontitis were significantly increased (P<0.01); 2) inflammatory cells in the gingival tissue increased significantly with the severity of periodontitis (P<0.01).2. Immunohistochemical staining results1) Compared to the normal group, the exp

22、ression standard of CD14 average positive cells in three groups of chronic periodontitis remarkably increased (P<0.01);2) Compared to the normal group, the expression standard of IL-10 average positive cells in three groups of chronic periodontitis reduced remarkably (P<0.01);3) Compared to th

23、e normal group, the expression standard of TNF- average positive cells in three groups of chronic periodontitis increased significantly (P<0.01).3. Immunofluorescence double staining results1) Compared with the normal group, the CD14+-IL-10+ cells density in the three groups of chronic periodonti

24、tis was significantly reduced (P<0.01); 2) Compared with the normal group, the density of CD14+-TNF-+ cells in the three groups of patients with chronic periodontitis increased significantly (P<0.01).4. Correlation between the degree of chronic periodontitis and the average positive rate of M,

25、 CD14+-IL-10+ cells and CD14+-TNF-+ cellsBy Pearson correlation analysis, the results showed that:1) The correlation between the degree of chronic periodontitis and the average positive cell rate of M and CD14+-TNF-+ cell density was a significant positive correlation; 2) The correlation between the

26、 degree of chronic periodontitis and the average positive cell rate of CD14+-IL-10+ cell density was a significant negatively correlation.Conclusion1. The average positive cell rate of M increased significantly with the severity of periodontal inflammation.2. The CD14+-TNF-+ cell density increased s

27、ignificantly with the severity of periodontal inflammation.3. The CD14+-IL-10+ cell density decreased significantly with the severity of periodontal inflammation.The process of periodontitis, M in gingival tissue participates in the periodontal anti-infectious immune response. IL-10 and TNF- secrete

28、d by M may play a key role in immune regulation through anti-inflammatory and anti-inflammatory effects during chronic periodontitis.KeywordsChronic periodontitis; Macrophage; IL-10; TNF-目 录中文摘要.英文摘要. 目录.前言.11. 牙周病的病因和发病机制.12. M分泌的IL-10与牙周炎关系的研究进展.33. M分泌的TNF-与牙周炎关系的研究进展.84. 本课题的研究目的和意义.10材料与方法.121.

29、 实验器材122. 病例选择、分组及标本收集.143. 实验操作方法.154. 统计学分析.20结果.211. 组织学观察结果212. 免疫组织化学染色观察结果223. 免疫荧光双染色染色观察结果.254. 免疫阳性细胞与慢性牙周炎程度相关性分析结果28讨论.311. 巨噬细胞参与人慢性牙周炎的免疫调节过程312. 双阳性巨噬细胞在慢性牙周炎牙龈组织中的表达及意义32结论.35参考文献.36附录一.45附录二（附图）.48附录三知情同意书.72VIII前 言1.牙周病的病因和发病机制牙周病（periodontitis diseases）是发生于牙齿周围组织的炎症性疾病，为口腔两大疾病之一，是导

30、致牙齿脱落的主要原因。依据累及部位的不同分为累及牙龈组织的牙龈病，以及累及牙周支持组织的牙周病两种1。牙周炎被认为是多因素疾病，目前认为牙周病的始动因子为牙菌斑生物膜及其产物，部分牙周致病菌所形成的抗原成分以及在其代谢的过程中所生成的酶以及毒素均可直接对牙周组织造成损伤，因此牙菌斑与牙周炎病程的进展密切相关2。牙周致病菌不仅对组织造成直接损伤，还可以通过刺激、调控宿主的免疫防御系统间接损伤牙周组织。牙周致病菌本身无法诱发产生牙周炎，已经有越来越多的研究结果显示，在疾病的发展过程中，机体的免疫系统处理感染因子的过程起到主要的作用。Th1以细胞免疫为主而Th2细胞以体液免疫为主，Th1、Th2之间

31、的平衡状态被认为是维持全身免疫系统内环稳定的重要因素，它们的异常分泌将引起炎症过程的失衡3-8。在相关的慢性牙周炎的临床资料中以及实验中显示，在牙周炎的早期稳定阶段，Th1细胞及其细胞因子起到主要的作用，在牙周组织病变程度加重时，Th2细胞起到主要作用 9-11。通过对牙龈沟液中所含的细胞因子的浓度加以分析对比，研究显示前列腺素2(prostaglandin, PGE2)、IL-1、干扰素（interferon-, IFN-）以及IL-2的浓度是增加的，IL-4、IL-6的浓度是减少的，可以推断在牙周组织的病变过程中，Th1型细胞因子的表达水平比Th2型细胞高12。在牙周炎形成、发展以及转归过

32、程中，以IFN-、TNF-为代表的Th1型细胞因子和以IL-4、IL-10为代表的Th2型细胞因子起到十分重要的作用。根据医学调查相关数据显示，我国轻度或重度牙周炎的成年人患者达80%-97% 13。研究表明，牙周炎不仅仅是引起牙齿脱落的重要因素，并且易影响全身健康而引起呼吸道疾病、心血管疾病以及风湿性关节炎等疾病14-15。有学者研究认为慢性牙周炎产生的细菌酶可能破坏了口腔粘膜表面，改变了呼吸道上皮通透性，从而降低宿主非特异性防御机制对潜在呼吸道病原菌的抵抗作用16-17。根据相关医学调查报告中的数据，口腔的卫生情况对于口腔疾病和呼吸道疾病有着较大的影响，其中口腔卫生状况差的患病几率要比有着

33、良好口腔卫生习惯的人群的患病几率高出450%。研究发现，导致呼吸道疾病的因素可能是因为牙周炎的炎症介质进一步感染。此外，当前有研究认为其他疾病也可能导致牙周炎的发生，如糖尿病患者病程后期多伴随牙周炎，因此牙周炎被认为是糖尿病的并发症之一18。牙周炎是由多类牙周致病菌、大量的炎性介质和多种不同的免疫细胞之间共同作用的结果，主要特点为牙周结缔组织的破坏、牙槽骨的吸收以及牙周附着水平的丧失。当前，在牙周炎的免疫应答机制上尽管已经作了大量的实验研究，但是，在引起牙周炎的感染的细胞因子以及相关的免疫机制仍未明确。2、M分泌的IL-10与牙周炎关系的研究进展 2.1 IL-10的结构IL-10是一种多功能

34、细胞因子，可以抑制T淋巴细胞以及单核细胞、M的活化与效应，对不同类型的造血细胞的作用也存在差异19。在以往的研究中发现IL-10最早是由Th2细胞所诱导生成的，其抑制IL-2、TNF-、INF-等细胞因子的产生。有研究报道，B细胞和B细胞淋巴瘤也发现产生IL-10，由此可推断在对宿主的免疫应答机制的抑制作用上，IL-10以及其同源物起到关键性作用。人类hIL-10基因由相应染色体上的5个外显子编码，激活的IL-10基因导致2kbhIL-10mRNAs表达20-25。IL-10可以由多种细胞表达，它的表达受到不同细胞类型不同机制的调控，在T细胞、单核细胞及M中，IL-10转录可以被转录信号肽1(

35、signal petide, SP)和转录因信号肽3调控，转录因子SP1和SP3由许多不同的细胞类型组成表达26-27。研究显示，IL-10抑制M的信号通路需要信号转导和转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3，stat3），IL-10受体末端15个氨基酸片段与Stat3一起在IL-10发挥作用，抑制M的活化，目前认为stat3是所有IL-10应答细胞中信号传导所必须的，但必须激活一种或多种途径实现IL-10对M活化的抑制28-30。2.2 IL-10的生物学效应IL-10对于单核细胞、M以及树突状细胞（dendrit

36、ic cells, DCs）都存在影响。IL-10能有效抑制IL-1、IL-1、IL-6、IL-12、GM-CSF、TNF等细胞因子的表达。在抗炎过程中，IL-10占据主要的作用，并且能够抑制TNF和IL-1的产生。在炎症的发生发展过程中，以上的细胞因子起到相互协同的作用，并且能够诱导炎症介质前列腺素（prostaglandin, PGE）、单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1, MCP1）、M炎症蛋白1（macrophage inflammatory proteins 1, Mip-1）、Mip-1、M衍生趋化因子（macrophage-d

37、eprived chemokine, MDC），由此可推断IL-10抑制大多数炎症细胞因子的表达 31-32。IL-10通过抑制基质金属蛋白酶2生成的作用从而抑制单核细胞及M外基质转换的能力，反而使金属蛋白酶组织抑制剂以及透明质酸（hyaluronic acid）的作用增加，进而促使血管的生成以及迁移。IL-10上调FcR (fc-gamma receptors)的表达可增强单核细胞及M吞噬细菌和真菌的能力33-35。IL-10还可下调了Toll样受体细胞4（toll-like receptors, TLR4）的表达，并增强了CD14、CD16、CD64和CD13的表达36-37。以上结果可推

38、断，IL-10可诱导巨噬细胞分化，并且限制正在进行的免疫反应和炎症，同时有助于增强吞噬作用消除感染。动物实验显示，在缺乏IL-10小鼠中发现自发性小肠炎、结肠炎等症状，也可说明IL-10主要功能是限制免疫应答的强度38-39。2.3 M分泌的IL-10在牙周免疫病理中的作用IL-10的主要由Th2细胞、活化B淋巴细胞、单核细胞、M生成，另外，还存在一些其他的细胞也可以诱导分泌IL-10，如CD8+T细胞、Th1细胞、角质细胞（Keratinocyte）以及肥大细胞（mast cell）等。IL-10的抑制作用主要是针对B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核细胞、M以及肥大细胞，通过对促炎因子的抑制作用进

39、而抑制CD4+T细胞合成、从而抑制TNF-、IL-1产生。M首先通过对TNF- 、IL-1的释放促使免疫应答的增强，再通过调节IL-10的释放，反馈性抑制相关炎症细胞因子的释放，从而达到免疫反应的平衡40-41。IL-10对牙周所起到的保护机制可能是由于抑制促炎因子及粘附因子、趋化因子的生成，减少了中性粒细胞及单核细胞迁移到炎症组织从而促使牙周修复。牙周炎中IL-10呈弥散式分布，且分布的十分广泛，在正常牙龈组织的M中检出IL-10表达明显，在牙周炎组织的M中只能检出少量的IL-10表达。实验研究显示，在牙周炎中，IL-10mRNA细胞呈阳性的较少，且一般情况下以牙龈的固有层的分布为主，其中有

40、的着色清晰易识别，有的集中分布在血管的周围，于上皮层无法见到较为明显的阳性表达的信号。 Lappin等42认为IL-10细胞在牙周组织中的表达增多即为牙周炎静止期的组织损伤特征，通过使用刮治及根面平整等对牙周炎进行治疗， 使得IL-10表达增加，表明其促使了牙周的修复。通过逆转录PCR反应对牙龈健康组以及牙周炎组中IL-10mRNA的表达情况进行对比研究，可知牙周炎组的IL-10mRNA表达水平较健康组显著减少43。通过采取多克隆抗体检测法对牙周炎的炎症组织中的IL-10的表达情况进行检测，可以发现Th2细胞在牙周炎的早期稳定期以及成人牙周炎的炎症组织中的表达水平较高42。因为没有系统性的对M

41、中的IL-10的表达情况作出研究，所以，对于牙周组织中M的IL-10对牙周致病菌抗原的识别过程以及对牙周病的调节免疫机制的阐述仍不明确。3、M分泌的TNF-与牙周炎关系的研究进展3.1 TNF-的结构Carswell等44于1975年在实验研究中发现，在小鼠的血清中发现肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）。在此之后，通过对TNF的进一步研究，发现其不仅具有针对肿瘤细胞的细胞毒性作用，还可以参与免疫调节以及多个炎症反应过程。依据不同的来源以及结构组成，TNF分为TNF-和TNF-。其中，TNF-即恶液素（cachectin），生成部位为活化的单核巨噬细胞；TNF-

42、即淋巴毒素（lytnphotoxin），生成部位是淋巴细胞。在宿主的免疫防御系统中，TNF具有广泛的致炎作用以及免疫调节作用，并且在病理状态下如败血症、牙周炎等皆出现表达过度的情况。TNF基因与主要组织相容性复合物基因紧密连锁。TNF-基因位于HLA-DR（human leukocyte antigens, HLA）和HLA-B位点之间的HLA-抗原基因簇，即染色体6p21.4区域44-46。TNF-与TNF-基因的组成均是3个内含子和4个外显子，除了第四个外显子之间高度同源之外，其余内含子及外显子都是不同源的47。TNF基因簇具备多中类型的多态性，如单个核苷酸的多态性（single nucl

43、eotide polymorphisms , SNP）、限制片段长度的多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）以及微卫星的多态性48-49。Udalova等45已经发现在TNF中存在五种微卫星即TNFae，TNFa、b、d是多等位基因，具有高度的多态性，TNFc是双等位基因，TNFe是三等位基因，此外有研究表明，上述等位基因和人类的MHC、位点之间存在着连锁不平衡性。有实验研究显示，TNF-的含量与个体的牙周炎的患病易感性以及病变的程度相关50-51。Calbraith等52-53研究认为在重度牙周炎的患者中存在的TNF2（G/A）

44、基因型人数比例较大。TNF通过与TNF受体（TNFR）进行结合发挥作用，TNF-家族中最早被发现的TNF受体为TNFR1及TNFR2，TNFR1参与了TNF-所有的活性功能，包括细胞凋亡、分化、增殖、抗菌和PGE的合成，TNFR2则介导部分特定细胞的功能如胸腺T细胞的增殖以及胰岛素的拮抗作用等54-56。3.2 TNF-的生物学效应TNF-通过与其受体相结合，从而启动鞘磷脂酶-神经酞胺（Sphingomyelinase-ceramide）信号转导通路、激活转录因子NF-K（nuclear factor- K）的信号通路、蛋白激酶（protein kinases）通路等，促进单核细胞及M对IL-

45、1、 IL-6、IL-8、以及TNF-的分泌，形成细胞因子级联反应。依据有关研究可知，TNF还能够通过增强激活中性粒细胞，从而使其表达的白细胞分化出抗原复合物CD11+/CD18+。另外TNF-还能激活EC使其表达细胞间粘附分子1与内皮细胞豁附分子1，使白细胞与EC之间产生作用，促进活性氧以及弹性蛋白酶的大量释放，并将损伤EC以及器官组织细胞，刺激EC细胞释放凝血因子III（blood coagulation factor III），进而启动凝血机制57-58。3.3 M分泌的TNF-在牙周免疫病理中的作用目前，通过大量的实验研究均可显示TNF-是由活化M分泌，但在中性粒细胞、自然杀伤细胞（n

46、atural killer cells, NK）、成纤维细胞（fibroblast）以及肥大细胞中也可诱导分泌TNF-59。在牙周炎中，TNF-作用于EC，诱导其合成黏附因子，进而使白细胞尤其是中性粒细胞以及单核细胞向EC黏附以及向组织内游出。TNF-还能介导生成各类效应T细胞、抗体以及促进B细胞的分化，通过对成纤维细胞的刺激而进一步生成PGE以及胶原酶，提升破骨细胞的活性60。TNF-的骨吸收的机制为使破骨细胞含量增多，同时降低骨基质的钙化程度。TNF-还能够通过对纤维细胞的组织结构进行改变，从而重组细胞骨架，并且介导合成胶原酶（collagenase）而促进胶原纤维(collagen fi

47、bers)的降解，因此可知，TNF-是促进牙槽骨吸收的一个重要的细胞因子61。有报道称：如果对牙周组织中TNF-及其受体的结合过程加以抑制，那么可以降低牙槽骨炎症部分的骨吸收能力62。4、本课题的研究目的和意义本次研究通过收集病变程度不同的牙周炎患者牙龈组织样本，制作组织学切片，采用H&E染色法、免疫组织化学以及免疫荧光双染色法，对牙龈组织的炎症程度、M以及双阳性M的表达情况进行观察。通过对牙周炎牙龈组织的炎症程度等级评分、计算M、CD14-IL-10和CD14-TNF-双阳性M的表达密度。分析M、CD14-IL-10和CD14-TNF-双阳性M与慢性牙周炎的病变程度的相关性及其在牙周

48、感染中的作用和作用机制；阐明M、CD14-IL-10和CD14-TNF-双阳性M在宿主免疫反应中的功能特征。研究结果将对后续以CD14-IL-10和CD14-TNF-双阳性M为靶点的研究慢性牙周炎的免疫预防提供分子基础和实验根据。材料与方法1.1实验器材11主要实验仪器及设备（表1）1.2主要实验试剂及药品（表2）2. 病例选择、分组及标本收集2.1牙周炎病例选择收集2015年12月-2016年6月就诊于中山市人民医院的牙周科门诊并自愿加入本研究的80例患者，年龄在2060岁，其中男47例（46岁±15岁），女33例(39岁±13岁)，患者年龄以及性别均不存在统计学差异。研

49、究对象纳入标准：一年内未进行过牙周手术的治疗；患有糖尿病的患者要被排除；排除处于妊娠期者；患有其他系统性疾病的患者也不能参与研究；短时间内服用过避孕药的患者要进行排除；同时，研究对象需要满足三个月内没有服用过抗生素类的药品的条件；在进行收集中重度慢性牙周炎患者牙龈组织之前，其必须作牙周基础治疗，且在疗程结束后牙周袋底仍存在出血（bleeding on probing ，BOP）现象者。2.2分组及标本收集2.2.1 分组依据 依据于1999年的美国牙周病学会制定的牙周病新分类作为标准63，将本次研究的80例患者平均分为四组，分别通过牙龈指数（GI）、牙周附着水平(AL)、牙周探诊深度（PD)作

50、为评估标准。2.2.2 确定分组，收集标本1)正常对照组：收集由于口腔正畸治疗需拔除但健康的前磨牙牙龈组织：无炎症、附着丧失、牙周袋以及牙槽骨吸收且BOP(-)。2)轻度慢性牙周炎组：收集临床牙冠延长术治疗的牙龈组织：轻度炎症、附着丧失不超过3 mm、牙周袋深度不超过4 mm以及X线片可见牙槽骨吸收程度在根长为1 /3 以内且BOP(+)。3)中度慢性牙周炎组：收集需进行牙周翻瓣术治疗的内斜切口牙龈组织：炎症较为明显、牙周袋深度在4-6 mm、附着丧失水平在3-5 mm且X线片可见牙槽骨吸收程度超过根长的1/3但在根长的2/3以内、患牙根部存在轻度松动以及分叉处轻度病损的可能且BOP（+）。4

51、)重度慢性牙周炎组：收集必须拔除的患牙或预后不良的患牙的牙龈组织：明显炎症、附着丧失水平超过5 mm、牙周袋深度超过6 mm、X线片可见牙槽骨吸收程度超过根长的2/3、患牙根分叉区域存在较严重的病损，其牙齿有多数松动且BOP(+)。3.实验操作方法3.1配制浓度为10%中性福尔马林固定液使用电子天平进行称重获得16.4 g的NaH2P04.12 H20以及5.2 g的NaH2P04.2H20，采用100 ml 40 %甲醛溶液溶解配置好的NaH2P04.12H20、NaH2P04.2H20，再倒入纯净蒸馏水900 ml，而后通过精准度高的pH计对溶液的酸碱度进行测定，且依据测定的pH值逐滴加入

52、高浓度的NaOH或者HCl溶液，进而将溶液逐渐调至中性。3.2标本的处理将所收集的牙龈组织标本加以处理，使用生理盐水对标本进行荡洗2-3次，每次2-3 sec，然后再将制备完成的标本于10 %中性福尔马林固定液即pH=7.0至少放置48 h。3.3制备组织切片玻片的处理：首先将载玻片与盖玻片在清洁液中放置24 h，再使用蒸馏水冲洗3 min，共冲洗5次，之后置于95 %酒精中进行浸泡2 h,干燥后放置在干燥箱中以作备用。1)脱水：将使用梯度酒精对已制备好的标本进行脱水处理，过程依次为：流动水进行漂洗4-5 h，再依次置于75 %酒精3 h、80 %酒精2 h、90 %酒精1 h、95 %酒精(

53、I)1 h、95 %酒精(II)1 h、无水乙醇(I)1 h以及无水乙醇(II)1 h浸泡处理；2)透明：运用二甲苯处理，使切片呈透明状态，过程依次为：二甲苯乙醇(1：1) 浸渍15 min、二甲苯(I)浸渍20 min、二甲苯(II) 浸渍20 min；3)浸蜡以及包埋，过程为：将组织置入熔点65 的石蜡浸渍1 h，然后再采用熔点62 的石蜡进行包埋。3.4 组织学染色及观察1)将石蜡切片加以常规脱蜡：先将切片放于62 烤箱中30 min，再使用二甲苯(I)浸渍15 min、二甲苯(II)15 min；2)采用梯度酒精对切片作复水，过程依次为：分别浸渍在无水乙醇(I)15 min、无水乙醇（

54、II）15 min、95 %酒精5 min、90 %酒精5 min、80 %酒精5 min、75 %酒精5 min后，取出切片再使用蒸馏水进行冲洗3 min后将水分甩干；3)苏木素染色：先将切片放在苏木素液中浸渍10-15 min，取出后再使用流动水对其进行漂洗3 min，再使用1 %盐酸酒精快速分化12 sec，然后使用蒸馏水进行对切片继续漂洗1 min，再把甩干水分，并且放在中和碱溶液中浸渍1 min，最后使用流动水漂洗3 min后将水分甩干；4)酒精脱水，过程依次为：分别置于80%酒精35 min、95%酒精（）35 min、95 %酒精（）35 min进行脱水处理；5)伊红染色：先将切

55、片放在1 %酒精伊红液浸渍10 min，然后依次继续使用无水乙醇（）5 sec、无水乙醇（）5 sec、无水乙醇（）5 sec加以洗涤，将水分甩干；6)透明、封片：先使用二甲苯（）以及二甲苯（）对切片进行作透明处理各3min，再使用中性树脂进行封片；3.5 免疫组织化学染色及观察1)将石蜡切片加以常规脱蜡：先将切片放于62 烤箱中30 min，再使用二甲苯(I)浸渍15 min、二甲苯(II)15 min；2)采用梯度酒精对切片作复水，过程依次为：分别浸渍在无水乙醇(I)15 min、无水乙醇（II）15 min、95 %酒精5 min、90 %酒精5 min、90 %酒精5 min、80 %酒精5 min、75 %酒精5 min后，取出切片再使用蒸馏水进行冲洗3 min后将水分甩干；3)PBS缓冲液对切片进行洗涤3次，每次3 min；4)微波辐射抗原修复：在柠檬酸盐缓冲液中将切片完全浸没，使用微波炉高火加热至100 ，改用中火继续加热切片20 min，然后放在室温下冷却至常温；5)再次使用PBS缓冲液对切片进行洗涤3次，每次3 min；6)内源性过氧化物：在全部的组织切片上滴加3 %H2O2去离子水（SP免疫组化检测试剂盒），在室温下对切片进行孵育10 min；7)PBS缓冲液洗涤3次，每次3 min；8)封闭：将组织切片上的PBS磷酸盐缓冲液