Western blot 技术-详细版

1、Western blot 实验技术 定义：n印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。n1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。n而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法Western Blot基本原理基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种

2、固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。快速、特异，信号弱、昂贵快速、特异，信号弱、昂贵信号强、二抗选择多，非特异性结信号强、二抗选择多，非特异性结合合nSDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳l转膜l封闭l一抗杂交l二抗杂交l底物显色n蛋白样品的制备裂解液SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理原理： M丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 MSDSM配胶的Tris缓冲液MTEMEDM过硫酸铵(时间)MTris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶成份凝胶成份大于大于20KD0.45 um20KD0.2 um7KD0.1 um转膜半干法半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间。（小分子量蛋白）湿法湿法将凝胶和固相基

3、质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中。（大分子量蛋白） 湿转半干转一抗、二抗孵育n把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37一小时，4 过夜。n倒掉一抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次10min。n加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37一小时，4 过夜。n倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次10min。辣根过氧化物酶法（HRP）碱性磷酸酶法（AP）化学发光显色法(HRP)DAB ？ 背景太高1.1.膜没有均匀浸湿膜没有均匀浸湿2.2.膜或者缓冲液污染膜或者缓冲液污染3.3.封闭不充分封闭不充分4.4.

4、抗体与封闭剂出现交抗体与封闭剂出现交叉反应叉反应5.5.抗体浓度过高抗体浓度过高 原原因因对对策策1.1.转膜前用转膜前用100%100%甲醇将膜完甲醇将膜完全浸湿全浸湿2.2.拿取膜与吸水纸时要戴手拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液套，更换新鲜转膜缓冲液3.3.检测一抗、二抗与封闭剂检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应是否有交叉反应4.4.杂交前检测一抗、二抗的杂交前检测一抗、二抗的工作浓度工作浓度没有阳性条带或比较弱1.1.抗体染色不充分抗体染色不充分2.2.靶蛋白含量太低靶蛋白含量太低3.3.HRPHRP抑制剂抑制剂4.4.转膜时间不够转膜时间不够5.5.曝光时间过短曝光时间过短 原原因因对对策策1.1.增加抗体滴度，延长孵育增加抗体滴度，延长孵育时间时间2.2.增加样本上样量增加样本上样量3.3.所用溶液和容器中避免含所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠有叠氮化钠4.4.大分量蛋白相应增加转膜大分量蛋白相应增加转膜时间及曝光时间时间及曝光时间弥散性条带或非特异性条带1.1.抗体浓度太高抗体浓度太高2.