白色念珠菌与抑菌效力检查方法

1、 白色念珠菌检查方法1、增菌培养、增菌培养 取供试液取供试液10ml（相当于（相当于供试品供试品1g、ml、10cm2）直接或处）直接或处理后接种至适量（不少于理后接种至适量（不少于100ml）的）的沙氏葡萄糖肉汤培养基中，培养沙氏葡萄糖肉汤培养基中，培养4872小时。小时。2、分离培养分离培养 取上述培养物划线接种取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养养2448小时（必要时延长至小时（必要时延长至72小小时）。时）。 结果判断 白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色偶见淡黄色，基上生长的菌落呈乳白色偶

2、见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。若平板上无菌落生长或生或有皱摺。若平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出白色念珠菌。判供试品未检出白色念珠菌。 2、如平板上生长的菌落与上述菌落形态特、如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选征相符或疑似，应挑选23个菌落分别接个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上，培养种至念珠菌显色培养基平板上，培养2448小时（必要时延长至小时（必要时延长至72小时）。若平小时）。若平板

3、上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试品未检出白色念珠菌。品未检出白色念珠菌。3、若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色，、若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色，挑取相符或疑似的菌落接种于挑取相符或疑似的菌落接种于1%吐温吐温80玉米琼脂培养基上，培养玉米琼脂培养基上，培养2448小时。小时。取培养物进行染色，镜检及芽管试验。取培养物进行染色，镜检及芽管试验。4、芽管试验挑取、芽管试验挑取1%吐温吐温80玉米琼玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片上，盖上盖玻片，置滴血清的载玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置湿润的平皿内，

4、置3537、13h，置显微镜下观察，可见到由孢子长出置显微镜下观察，可见到由孢子长出短小芽管。短小芽管。5、若上述疑似菌为非革兰阳性菌，显、若上述疑似菌为非革兰阳性菌，显微镜未见厚膜孢子、假菌丝、芽管，微镜未见厚膜孢子、假菌丝、芽管，判供试品未检出白色念珠菌。判供试品未检出白色念珠菌。 抑菌剂效力测定抑菌剂效力测定概述概述 1、抑菌剂效力检查法系用于测定灭菌、抑菌剂效力检查法系用于测定灭菌、非灭菌制剂中抑菌剂的活性，以评价最终非灭菌制剂中抑菌剂的活性，以评价最终产品的抑菌效力，同时也可用于指导生产产品的抑菌效力，同时也可用于指导生产企业在制剂研发阶段抑菌剂的确定。企业在制剂研发阶段抑菌剂的确定

5、。 2、如果药物本身不含有充分的抗菌活性，、如果药物本身不含有充分的抗菌活性，那么应根据制剂特性（如水溶液制剂）添那么应根据制剂特性（如水溶液制剂）添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常储存加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常储存和使用过程中可能发生微生物污染和大量和使用过程中可能发生微生物污染和大量繁殖尤其多剂量包装的制剂，避免因药物繁殖尤其多剂量包装的制剂，避免因药物微生物污染及对患者造成伤害。微生物污染及对患者造成伤害。 3、所有抑菌剂都具有一定的毒性，、所有抑菌剂都具有一定的毒性，而且在贮存过程中其有效性有可能因而且在贮存过程中其有效性有可能因药物的活性成分提高或降低，为保证药物的活性成分提高

6、或降低，为保证药品的质量和用药安全，添加防腐剂药品的质量和用药安全，添加防腐剂的量应根据制剂本身是否具抗菌活性，的量应根据制剂本身是否具抗菌活性，保持最低有效量并在药品包装上注明保持最低有效量并在药品包装上注明添加抑菌剂的名称和数量。添加抑菌剂的名称和数量。 培养基培养基 1、胰酪胨大豆肉汤培养基、胰酪胨大豆肉汤培养基 2、胰酪胨大豆肉汤培养基、胰酪胨大豆肉汤培养基 3、 沙氏葡萄糖肉汤培养基沙氏葡萄糖肉汤培养基 培养基的适用性检查培养基的适用性检查 菌种 铜绿假单胞菌pseudomonasaeruginosa） 金黄色葡萄球菌（staphycococcus） 白色念球菌（Candida al

7、bicans） 黑曲霉（Aspergillus niger） 大肠埃希菌（Escherichia Coli） 菌液的制备同控制菌培养基适用性检查 适用性检查 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌各菌各50100cfu，分别注入无菌平皿中，立即，分别注入无菌平皿中，立即倾注胰酷胨大豆琼脂培养基，每株试验菌平行倾注胰酷胨大豆琼脂培养基，每株试验菌平行制备制备2个平皿，混匀，凝固，置个平皿，混匀，凝固，置3035培养培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉各小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉各50100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注沙氏，分别注入无菌

8、平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平个平皿，混匀，凝固，置皿，混匀，凝固，置2025培养培养72小时，计小时，计数；同时，用对应的对照培养基替代被检培养数；同时，用对应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。基进行上述试验。 结果判定结果判定 被检培养基的菌落数与对照培养基菌被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比大于落数相比大于70%，菌落形态大小应，菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。养基的适用性检查符合规定。 抑菌剂效力测定抑菌剂效力测定 供试品分类供试品分类

9、 为了达到试验目的，根据供试品的给药为了达到试验目的，根据供试品的给药途径和用途将供试品分为四类，以便标途径和用途将供试品分为四类，以便标准的制定和执行，但对于一些抗酸性制准的制定和执行，但对于一些抗酸性制剂和含活生物制剂应考虑会降低有益菌剂和含活生物制剂应考虑会降低有益菌的生物活性。见表的生物活性。见表 表表 产品分类产品分类 类别类别 药药 品品 1 类类 注射剂、其他非肠道制剂，包括乳剂、注射剂、其他非肠道制剂，包括乳剂、 耳用耳用 制剂、无菌鼻用制剂及眼用制剂制剂、无菌鼻用制剂及眼用制剂 2 类类 局部给药制剂、非灭菌鼻用制剂及用于局部给药制剂、非灭菌鼻用制剂及用于 黏膜的乳剂黏膜的乳

10、剂 3 类类 口服非固体制剂（非抗酸制剂）口服非固体制剂（非抗酸制剂） 4 类类 非固体抗酸制剂非固体抗酸制剂 菌种和菌液的制备同培养基适用性检查菌种和菌液的制备同培养基适用性检查 供试品接种供试品接种 1、抑菌剂效力可能受试验用容器特征的影响，如、抑菌剂效力可能受试验用容器特征的影响，如容器的材质、形状、体积及封口的方式等。因此，容器的材质、形状、体积及封口的方式等。因此，只要供试品每个包装容器的装量足够试验用，同只要供试品每个包装容器的装量足够试验用，同时容器便于按无菌操作的接入试验菌液、混合及时容器便于按无菌操作的接入试验菌液、混合及取样等，一般应将试验菌直接接种于供试品原包取样等，一般

11、应将试验菌直接接种于供试品原包装容器中进行贮存。装容器中进行贮存。 2、若因供试品的性状或每个容器装量、若因供试品的性状或每个容器装量等因素需将供试品转移至无菌容器时，等因素需将供试品转移至无菌容器时，该容器的材质不得影响供试品的特性该容器的材质不得影响供试品的特性（如吸附作用），特别应注意不得影（如吸附作用），特别应注意不得影响供试品的响供试品的PH，PH对抑菌剂的活性影对抑菌剂的活性影响很大，同时容器的口径大小应便于响很大，同时容器的口径大小应便于供试品的进出及混匀。供试品的进出及混匀。3、 取包装完整的供试品至少取包装完整的供试品至少5份，直接接份，直接接种试验菌，或取适量供试品分别转移

12、至种试验菌，或取适量供试品分别转移至5个适宜的无菌容器中（若试验菌侏数超过个适宜的无菌容器中（若试验菌侏数超过5株，应增加相应的供试品份数），每一株，应增加相应的供试品份数），每一容器接种一个试验菌。容器接种一个试验菌。4、1、2、3类供试品类供试品1g或或1ml接种菌量为接种菌量为105106cfu，4类供试品中类供试品中1g或或1ml接接种菌量为种菌量为106108cfu，接种菌液的体积，接种菌液的体积不得超过供试品体积的不得超过供试品体积的05%1% ，充分混合，使供试品中的试验菌均匀分布。充分混合，使供试品中的试验菌均匀分布。5、将接种的供试品在试验期间置、将接种的供试品在试验期间置2

13、025，避光贮存，贮存温度的变化应尽，避光贮存，贮存温度的变化应尽可能控制在最小范围，并防止被污染。可能控制在最小范围，并防止被污染。 存活菌数测定存活菌数测定 由于供试品中含有抑菌活性，所以菌数由于供试品中含有抑菌活性，所以菌数测定方法应进行验证。根据菌数测定结测定方法应进行验证。根据菌数测定结果，计算果，计算1ml(g)供试品各试验菌所加的供试品各试验菌所加的菌数及各间隔时间的菌数，并换算成菌数及各间隔时间的菌数，并换算成lg值。值。 测定细菌用胰酷胨大豆琼脂培养基，测定真菌测定细菌用胰酷胨大豆琼脂培养基，测定真菌用沙氏葡萄糖琼脂培养基用沙氏葡萄糖琼脂培养基 根据产品类型，在规定的接种时间

14、，分别从上根据产品类型，在规定的接种时间，分别从上述每个容器中取供试述每个容器中取供试ml(g)，用，用pH7.0无菌氯化无菌氯化钠钠-蛋白胨缓冲液稀释成蛋白胨缓冲液稀释成1：10、1：102、1：103等稀释级。等稀释级。 结果判断结果判断 1、抑菌剂效力根据各间隔时间测定的菌数、抑菌剂效力根据各间隔时间测定的菌数1.0 lg值相对于初始值（值相对于初始值（0时菌数时菌数1.0 lg值）值）减少程度进行评价（见表），试验结果按有减少程度进行评价（见表），试验结果按有效数字的修约规则进舍，保留一位小数点。效数字的修约规则进舍，保留一位小数点。结果符合表，要求可判断该产品抑菌效力符结果符合表，要

15、求可判断该产品抑菌效力符合规定。合规定。 表 防腐剂抗菌效力标准 1 类类 供供 试试 品品 细细 菌菌 7天菌数下降不少于天菌数下降不少于1.0 lg，14天菌数下降天菌数下降 不少于不少于3.0 lg ，第，第14天到天到28天菌数不增加。天菌数不增加。 真真 菌菌 与初始值比，到与初始值比，到7、14、28天菌数均不增加。天菌数均不增加。 2 类供类供 试试 品品 细细 菌菌 14天菌数下降不少于天菌数下降不少于2.0 lg ， 14天到天到28天菌数天菌数 不增加。不增加。 真真 菌菌 与初始值比，到与初始值比，到14、28天菌数均不增加。天菌数均不增加。 3 类类 供供 试试 品品

16、细细 菌菌 14天菌数下降不少于天菌数下降不少于1.0 lg ， 14天到天到28天菌数均不增加。天菌数均不增加。 真真 菌菌 与初始值比，与初始值比，14、28天菌数均不增加。天菌数均不增加。 4 类类 供供 试试 品品 细菌，真细菌，真 菌菌 与初始值比，与初始值比，14、28天菌数均不增长。天菌数均不增长。注注：1、表中、表中“不增加不增加”是指对前一个测定时间，试验菌增加的数量不超过是指对前一个测定时间，试验菌增加的数量不超过0.5 lg。 2、0时菌数时菌数 供试品加入试验菌，摇匀，立即取样检查，培养，计数，为供试品加入试验菌，摇匀，立即取样检查，培养，计数，为0时时 举 例1、 氯化钠注射液、氯化钠注射液、 碳酸氢钠注射液不含抑菌剂加入碳酸氢钠注射液不含抑菌剂加入菌从初始到菌从初始到6h就开始无限增加，不具抑菌力，抗病就开始无限增加，不具抑菌力，抗病毒口服液从初始到毒口服液从初始到24 h对数值无变化，对数值无变化，72h后明显后明显降低，具一定的抑菌力。降低，具一定的抑菌力。2、呋麻滴鼻液、硫糖铝混悬液、阿昔洛韦滴眼液、鲸、呋麻滴鼻液、硫糖铝混悬液、阿昔洛韦滴眼液、鲸脂滴耳液、洁尔阴洗液从初