蛋白质分子基础4蛋白质制备 ppt课件

1、蛋白质的电泳电泳分别的原理电泳分别的原理: 蛋白质是两性电解质蛋白质是两性电解质,在一定的在一定的pH下下,可以可以解离为带电荷的离子。在电场中可以电泳挪解离为带电荷的离子。在电场中可以电泳挪动。动。电泳迁移率：带电颗粒在溶液中迁移速度的电泳迁移率：带电颗粒在溶液中迁移速度的快慢，用电泳迁移率快慢，用电泳迁移率(M)表示：表示： M为迁移率；为迁移率；dL为颗粒挪动的间隔；为颗粒挪动的间隔；L为为通电的时间。通电的时间。E为两个电极之间的电势差。为两个电极之间的电势差。M=EtdL蛋白质分子的性质。蛋白质分子的性质。 分子的电荷、大小和外形。分子的电荷、大小和外形。电场电场 与电流和电压成正比

2、。与电流和电压成正比。缓冲液和离子强度缓冲液和离子强度 缓冲液离子强度增大，样品所带电荷降缓冲液离子强度增大，样品所带电荷降低，样品的泳动速度会减缓。低，样品的泳动速度会减缓。支持介质支持介质 纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附作纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附作用较小。用较小。自在界面电泳自在界面电泳运用支持物的区带电泳。运用支持物的区带电泳。 区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。支持介质的作用主要是为上或支持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防

3、止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。的高密度而产生的对流。 区带电泳运用不同的支持介质，早期有滤纸、区带电泳运用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，如今那么多用聚丙烯酰胺维素膜，如今那么多用聚丙烯酰胺PAGE和和琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶。SDS-PAGE凝胶等电聚焦凝胶等电聚焦在蛋白质中参与摩尔比为在蛋白质中参与摩尔比为1.4：1(SDS:蛋白质蛋白质)的的SDS(

4、十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠)。使一切蛋白质都带上负。使一切蛋白质都带上负电。电。SDS是阴离子去污剂，能与蛋白质的疏水部分结是阴离子去污剂，能与蛋白质的疏水部分结合，并且把大部分蛋白质拆成组成他的亚基方式。合，并且把大部分蛋白质拆成组成他的亚基方式。在上样缓冲液中参与巯基乙醇，可以使二硫键复在上样缓冲液中参与巯基乙醇，可以使二硫键复原为巯基。使不同的蛋白质分子的短轴一致，长原为巯基。使不同的蛋白质分子的短轴一致，长轴与蛋白质的分子量成正比。轴与蛋白质的分子量成正比。SDS-PAG中，蛋白质电泳的速度不再取决于蛋中，蛋白质电泳的速度不再取决于蛋白质的电荷与外形，只与蛋白质的分子量有关。白质的电

5、荷与外形，只与蛋白质的分子量有关。当分子量在当分子量在15KD15KD到到200KD200KD之间时，蛋白之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：符合下式：logM=K-bXlogM=K-bX M M为分子量，为分子量，X X为迁移率，为迁移率，k k、b b均为常均为常数，假设将知分子量的规范蛋白质的迁移数，假设将知分子量的规范蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条规范曲率对分子量对数作图，可获得一条规范曲线，未知蛋白质在一样条件下进展电泳，线，未知蛋白质在一样条件下进展电泳，根据它的电泳迁移率即可在规范曲线上求根据它的电泳迁移率即可

6、在规范曲线上求得分子量。得分子量。绘制规范曲线：绘制规范曲线： 按下式计算相对迁移率：按下式计算相对迁移率： 以每个蛋白规范的分子量对数对它的相对迁移以每个蛋白规范的分子量对数对它的相对迁移率作图得规范曲线，量出未知蛋白的迁移率即可率作图得规范曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。上的样品的分子量测定才具有可靠性。= 蛋白样品距加样端迁移距离（cm）溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm） 相对迁移率PAGEPAGE根据其有无浓缩效应，分为延续系统和不根据其有无浓缩效应，分为延续系统和不延续

7、系统两大类，延续系统电泳体系中缓冲液延续系统两大类，延续系统电泳体系中缓冲液pHpH值及凝胶浓度一样，带电颗粒在电场作用下，值及凝胶浓度一样，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。主要靠电荷和分子筛效应。不延续系统中由于缓冲液离子成分，不延续系统中由于缓冲液离子成分，pHpH，凝胶，凝胶浓度及电位梯度的不延续性，带电颗粒在电场中浓度及电位梯度的不延续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因此其分别条带明晰度及分辨率均较前者效应，因此其分别条带明晰度及分辨率均较前者佳。佳。 分离胶分离胶(10%.5ml) 浓缩胶浓缩

8、胶(5%.3ml) H2O 2.6ml 0.7ml 30%Acr 1.7ml 1.5ml Buffer 3.0mol/L pH=8.8 Tris-HCl 0.6ml 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 0.75ml 10%SDS 0.05ml 0.03ml 10%Ap 0.05ml 0.03ml TEMED 5l 4l 不延续不延续SDS-PAGE各部分凝胶配制各部分凝胶配制电泳槽中参与缓冲液，接通电源，进展电泳，开场电流恒电泳槽中参与缓冲液，接通电源，进展电泳，开场电流恒定在定在10mA，当进入分别胶后改为，当进入分别胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶，溴酚蓝距凝胶边缘约边缘约5m

9、m时，停顿电泳。时，停顿电泳。Figure 6.2.4 SDS-PAGE results of fraction S1 (SRA)制备凝胶时，制备凝胶时，TEMED要加胶之前再加。要加胶之前再加。电泳之前蛋白质要溶解在含电泳之前蛋白质要溶解在含1%的的SDS和和1%的巯的巯基乙醇的磷酸缓冲液基乙醇的磷酸缓冲液(0.01 mol/L, pH 7.2),1000C加热加热25分钟。分钟。如凝胶中含有杂质，可以在参与样品前先预电泳如凝胶中含有杂质，可以在参与样品前先预电泳0.51小时。小时。SDS与蛋白质分子结合后，蛋白质分子的构象发与蛋白质分子结合后，蛋白质分子的构象发生变化，解离为亚单位，电泳结

10、果显示的只是亚生变化，解离为亚单位，电泳结果显示的只是亚单位的大小，同时蛋白质也会失去原来的活性。单位的大小，同时蛋白质也会失去原来的活性。已发现有些蛋白质不能用已发现有些蛋白质不能用SDS-PAGE测定分子量。测定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质某些糖蛋白以及一些构造蛋白，如的蛋白质某些糖蛋白以及一些构造蛋白，如胶原蛋白等。胶原蛋白等。 蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化 。在电场存在下的一定pH溶液中，带正电的蛋白分子将向负极挪动而带负电的蛋白分子将向正极挪动，在某一pH时，蛋白

11、分子在电场中不再挪动，此时的pH值即为该蛋白质的等电点。 等电聚焦(IEF电泳就是在凝胶中参与两性电解质从而构成从正极到负极pH逐渐添加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等电点。根据要分别的蛋白质的根据要分别的蛋白质的pI的不同，订购不同的不同，订购不同pH梯度的凝胶，可以对蛋白质样品进展分别。梯度的凝胶，可以对蛋白质样品进展分别。 如如3.59.5、2.56.0、5.08.5、7.510等。等。凝胶的凝胶的pH值范围越窄，分辨力越高。可分别等值范围越窄，分辨力越高。可分别等电点相差电点相差0.01个个

12、pH单位的蛋白质，最高可以分单位的蛋白质，最高可以分辨辨0.0025个个pH单位的蛋白质。单位的蛋白质。等电凝胶可以抵消分散作用，蛋白质可以富集在等电凝胶可以抵消分散作用，蛋白质可以富集在很窄的区带上。很窄的区带上。适用于少量蛋白质样品的分析鉴定，不适用于大适用于少量蛋白质样品的分析鉴定，不适用于大量制备。量制备。要求用无盐的溶液，而蛋白质在无盐溶液中容易要求用无盐的溶液，而蛋白质在无盐溶液中容易沉淀；在等电点发生沉淀和变性的蛋白质也不适沉淀；在等电点发生沉淀和变性的蛋白质也不适宜用次方法分别。宜用次方法分别。可以用染色法察看蛋白质，然后用外表电可以用染色法察看蛋白质，然后用外表电极直接丈量极

13、直接丈量pH值。值。或将凝胶切成小块，加蒸馏水，再捣碎凝或将凝胶切成小块，加蒸馏水，再捣碎凝胶块并且丈量胶块并且丈量pH。双向电泳双向电泳:由第一向等电聚焦由第一向等电聚焦(IEF)电泳和第二向电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)组成，组成，第一向使等电点不同的蛋白得到分别，第二向使第一向使等电点不同的蛋白得到分别，第二向使分子量不同的蛋白得到分别，两向结合便得到高分子量不同的蛋白得到分别，两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。分辨率的蛋白图谱。1975年，年，OFarrell首先运用双向电泳技术将大首先运用双向电泳技术将大肠杆菌总蛋白分别出肠杆菌总蛋白分别

14、出1100多个蛋白点。后来此多个蛋白点。后来此技术不断用于原核生物和真核生物总蛋白的分别。技术不断用于原核生物和真核生物总蛋白的分别。目前，随着蛋白质组学的开展，双向电泳技术越目前，随着蛋白质组学的开展，双向电泳技术越来越广泛的用于发现未知蛋白。来越广泛的用于发现未知蛋白。考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法 可检出可检出0.31ug的蛋白质。的蛋白质。银染色法银染色法 银离子与蛋白质以盐或配价络盐的方式结合，银离子与蛋白质以盐或配价络盐的方式结合，用甲醛将银离子复原为可见的银颗粒。可检测用甲醛将银离子复原为可见的银颗粒。可检测ng程度的蛋白质。程度的蛋白质。荧光染色技术荧光染色技术 荧光合成物质

15、与荧光合成物质与PAGE上的蛋白质发生反响，上的蛋白质发生反响，发出剧烈的荧光，可检测到发出剧烈的荧光，可检测到PAGE中的蛋白质。中的蛋白质。蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进展检测。对蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进展检测。对知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进展检测，知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进展检测，对新基因的表达产物，可经过交融部分的抗体检对新基因的表达产物，可经过交融部分的抗体检测。测。采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，质，“探针是抗体，探针是抗体，“显色用标志的二抗。显色用标志的二抗。详细操作为经过详细操作为经过PAGE分别

16、的蛋白质样品，转移分别的蛋白质样品，转移到固相载体例如硝酸纤维素薄膜上，固相载到固相载体例如硝酸纤维素薄膜上，固相载体以非共价键方式吸附蛋白质。以固相载体上的体以非共价键方式吸附蛋白质。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反响，再与酶或同位素标志的第二抗体起反响，经响，再与酶或同位素标志的第二抗体起反响，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分别的特异过底物显色或放射自显影以检测电泳分别的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛运用性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛运用于检测蛋白程度的表达。于检测蛋白程度的表达。抗原包被的实验膜条抗

17、原包被的实验膜条 特异性人抗体特异性人抗体标志的二抗标志的二抗标志标志蛋白质的结晶蛋白质的结晶可以作为蛋白质提纯的方法之一。蛋白质可以作为蛋白质提纯的方法之一。蛋白质纯度到达一定值时可以结晶。经过反复重纯度到达一定值时可以结晶。经过反复重结晶可以除去其中的杂质，使蛋白质得到结晶可以除去其中的杂质，使蛋白质得到更大程度的纯化。更大程度的纯化。蛋白质结晶体是比较稳定的构造，所以结蛋白质结晶体是比较稳定的构造，所以结晶可以作为一个稳定的储存的方法。晶可以作为一个稳定的储存的方法。在蛋白质结晶之后，可以提供作在蛋白质结晶之后，可以提供作X射线衍射线衍射分析用的资料，来分析蛋白质的构造等射分析用的资料，

18、来分析蛋白质的构造等数据。数据。蛋白质溶液在适宜的过饱和形状，溶质分子经过分散、旋转、碰撞等运动方式，可以构成晶核。溶质分子以相互碰撞的作用方式有序而反复地堆砌在晶核上，直到晶核生长到晶体，最后从溶液中析出。蛋白质纯度越高，结晶越容易，至少要在蛋白质纯度越高，结晶越容易，至少要在50%以以上。上。蛋白质浓度。浓度越高，结晶时机越大。但过大蛋白质浓度。浓度越高，结晶时机越大。但过大会因杂质存在而导致晶形不好。普通结晶的蛋白会因杂质存在而导致晶形不好。普通结晶的蛋白质浓度在质浓度在1050 mg/mL。温度。蛋白质结晶温度在温度。蛋白质结晶温度在0400C。普通在。普通在40C冷室或冷室或250C

19、温箱中进展。温箱中进展。pH。普通在蛋白质的等电点的。普通在蛋白质的等电点的pH附近结晶。附近结晶。金属离子和离子强度。一些二价离子可以引起或金属离子和离子强度。一些二价离子可以引起或有利于蛋白质的结晶过程。有利于蛋白质的结晶过程。沉淀剂。沉淀剂沉淀剂。沉淀剂(如盐类和各种有机溶剂如盐类和各种有机溶剂)可改动可改动蛋白质的溶解度。理想的沉淀剂有：聚乙二醇蛋白质的溶解度。理想的沉淀剂有：聚乙二醇(PEG)和和2-甲基甲基-2，4-戊二醇戊二醇(MPD)。盐析法盐析法 在蛋白质溶液中参与盐，使蛋白质溶解度降低，在蛋白质溶液中参与盐，使蛋白质溶解度降低，之后以结晶方式从溶液中析出。之后以结晶方式从溶

20、液中析出。有机溶剂法有机溶剂法 有机溶剂可以使蛋白质介电常数降低，导致蛋有机溶剂可以使蛋白质介电常数降低，导致蛋白质结晶析出。白质结晶析出。等电点结晶。等电点结晶。 蛋白质在等电点时溶解度最小，可以构成结晶。蛋白质在等电点时溶解度最小，可以构成结晶。脱盐结晶。脱盐结晶。 一些球蛋白溶于盐而几乎不溶于水，可将溶一些球蛋白溶于盐而几乎不溶于水，可将溶于盐溶液的蛋白质结晶而出，然后透析除盐。于盐溶液的蛋白质结晶而出，然后透析除盐。温差除盐。适用于一些对温度敏感的蛋白质，不温差除盐。适用于一些对温度敏感的蛋白质，不同温度溶解度变化大。可运用此法。同温度溶解度变化大。可运用此法。金属离子。在某些蛋白质溶

21、液中参与金属离子，金属离子。在某些蛋白质溶液中参与金属离子，可以促进晶体的构成。可以促进晶体的构成。蛋白质提纯过程中的定量蛋白质提纯过程中的定量定氮法丈量蛋白质含量定氮法丈量蛋白质含量蛋白质含量克蛋白质含量克% =每克生物样品中含氮的克数每克生物样品中含氮的克数 6.25双缩脲法双缩脲法 第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。 双缩脲试剂的成分是质量浓度为双缩脲试剂的成分是质量浓度为0.1 g/mL的的氢氧化钠溶液和质量浓度为氢氧化钠溶液和质量浓度为0.01 g/mL的硫酸的硫酸铜溶液。在碱性溶液铜溶液。在碱性溶液(NaOH)中中,双缩脲双缩脲(H2NOCNH

22、CONH2)能与能与Cu2+作用作用,构成构成紫色或紫红色的络合物紫色或紫红色的络合物,这个反响叫做双缩脲这个反响叫做双缩脲反响。反响。 由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲构造类由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲构造类似的肽键似的肽键,因此因此,含两个或亮个以上的肽键化合含两个或亮个以上的肽键化合物尤其是蛋白质都可与双缩脲试剂发生颜色反物尤其是蛋白质都可与双缩脲试剂发生颜色反响。响。福林福林- -酚试剂法：酚试剂法： 在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反响，生成蓝色剂与酪氨酸上的酚发生反响，生成蓝色化合物，在化合物，在600 nm 600 nm 下

23、测光吸收。可根据下测光吸收。可根据测得的规范曲线计算出蛋白质的含量。测得的规范曲线计算出蛋白质的含量。灵敏度较高，可达灵敏度较高，可达2525g-250 g-250 g/mlg/ml。灵敏度比灵敏度比280 nm 280 nm 处的紫外吸收法灵敏处的紫外吸收法灵敏1010倍，比双缩脲法灵敏倍，比双缩脲法灵敏100100倍。倍。 紫外吸收法紫外吸收法A.280nmA.280nm光吸收法光吸收法 根据得到的根据得到的280 nm280 nm的光吸收值与蛋白的光吸收值与蛋白质的浓度正比，可以丈量蛋白质溶液中质的浓度正比，可以丈量蛋白质溶液中的浓度。的浓度。B.280nmB.280nm和和260nm260nm的吸收差法的吸收差法 用用280nm280nm下的紫外吸收减去下的紫外吸收减去260nm260nm下的下的紫外吸收，可以排除紫外吸收，可以排除260nm260nm下由于核酸吸下由于核酸吸光带来的干扰。光带来的干扰。蛋白质浓度蛋白质浓度(mg/mL)=1.45(mg/mL)=1.45* *A280nm-A280nm-0.740.74* *A260nmA26