基因工程的基本序列概述

1、1.2 基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子终止子 RNA聚合酶能够识别结合位点，并与其结合。 转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。 转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子 外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终

2、止子编码区上游 编码区下游 内含子： 外显子： 原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考 编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因2 2、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些? ?请阅读P9第一和二两段基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如:cDNA文库）文库）1.1.基因文库基因文库2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法鸟枪法：鸟枪法：供体细胞中的供体细胞中的DNADNA许多许多D

3、NADNA片段片段运载体运载体限制酶限制酶与载体连接与载体连接载入载入受体细胞受体细胞产生特定性状产生特定性状导入导入外源外源DNADNA扩增扩增目的基因目的基因分离分离( (直接分离法直接分离法) )( (一一) )从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因目的基因的目的基因的mRNAmRNA杂交双链杂交双链( (单链单链RNA/RNA/单链单链DNA)DNA)单链单链DNADNA反转录酶反转录酶核酸酶核酸酶H H2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNADNA( (目的基因目的基因) )求求异异思思维维 你能推测出由你能推测出由mRNA反转录形

4、成反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？的过程大致分为哪些步骤吗？反转录酶既可以利用反转录酶既可以利用DNA又可以利用又可以利用RNA作为模板合成与之互补的作为模板合成与之互补的DNA链。像其他链。像其他DNA聚合酶一样，反转录酶也以聚合酶一样，反转录酶也以53方向合成方向合成DNAcDNA合成过程是：第一步，反转录酶以合成过程是：第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNA互补的互补的DNA单链，形成单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶杂交分子。第二步，核酸酶H使使RNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的链降解，使之变成单链的DN

5、A。第三。第三步，以单链步，以单链DNA为模板，在为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链链，形成双链DNA分子。分子。根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ：蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？操作简便操作简便广泛使用广泛使用工作量大，盲目，工作量大，盲目，分离出来的

6、有时并分离出来的有时并非一个基因非一个基因专一性强专一性强操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不稳定，要很不稳定，要求的技术条件较高求的技术条件较高专一性最强专一性最强仅限于合成核苷酸仅限于合成核苷酸对较少的简单基因对较少的简单基因寻寻根根问问底底1.为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？内提取不行吗？构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以直接获得，也可以通过反转录，所需要的目的基因序列已知，就可以直

7、接获得，也可以通过反转录，用用PCR方式从方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，

8、往往就需要构建基因文库。往往就需要构建基因文库。( (二二) )利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _、_ (_ (做启动子做启动子) )、 _._.前提条件：前提条件：原理：原理：_方式：方式：以以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增为扩增循循 环的次数）环的次数）结果：结果：选修选修1 P1 P6060聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四

9、种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增( (二二) )利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因b、PCR（聚合酶链式反应）技术扩增（聚合酶链式反应）技术扩增由穆里斯等人于由穆里斯等人于1988年发明，并于年发明，并于1993年获得若贝尔化学奖。年获得若贝尔化学奖。PCR反应的过程：（变性、退火、延伸、多次重复）反应的过程：（变性、退火、延伸、多次重复）变性变性退火退火延伸延伸结果：双链结果：双链DNA分子数为分子数为2n可获取大量目的基因可获取大量目的基因过程：过程：a

10、 a、DNADNA变性变性（90-9690-96）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性25-6525-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端端延伸，合成与模板互补延伸，合成与模板互补 的的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链寻根问底寻根问底将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，将目的基因直接导入受

11、体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？结果会怎样？ 有人采用总有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物导入了受体植物,不好检测与筛选不好检测与筛选,同时也无法增强目的基因的表达同时也无法增强目的基因的表达水平水平,也不能确定目的基因产物的存在部位。也不能确定目的基因产物的存在部位。构建

12、基因表达载体的目的构建基因表达载体的目的a、使目的基因在受体细胞中稳定遗传的、使目的基因在受体细胞中稳定遗传的b、使目的基因复制并遗传给下一代、使目的基因复制并遗传给下一代c、同时使目的基因能表达和发挥作用。、同时使目的基因能表达和发挥作用。1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。( (二二) )基因表达载体的构建基因表达载体的构建 核心核心3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_ _处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形

13、成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒） 核心核心同一种同一种( (二二) )基因表达载体的构建基因表达载体的构建4.4.过程过程: :5.5.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：复制原点复制原点+ +目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标

14、记基因标记基因它们有什么作用？它们有什么作用？( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞转化转化 方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1 1）农杆

15、菌介绍）农杆菌介绍（2 2）原理及适用范围）原理及适用范围( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？上说，你应该如何做？原因原因：研究证明，主要酚类诱导物为：研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮乙酰丁香酮和和羧基乙酰丁香羧基乙酰丁香酮酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中

16、合成，通常不存在于单，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：点：要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活等，目的是使农杆

17、菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体转移并插入到染色体DNA上。上。( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等

18、方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）（注意与上不同之处）抗原抗体杂交抗原抗体杂交 细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。步培养、研究。无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物例：用棉铃饲喂棉铃例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基症状，说明未

19、摄入目的基因或摄入目的基因未表达。因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到明摄入了抗虫基因并得到表达。表达。（从个体水平鉴定）（从个体水平鉴定）DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍

20、然是两条游离的单链。 P P1515思考与探究思考与探究基因工程操作流程图基因工程操作流程图小小 结：结：1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C C2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A

21、、能复制、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNA3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶4）有关基因工程的叙述正确的是）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得

22、目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料资料5）基因工程是在）基因工程是在DNA分子水平上进行设计分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是碱基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达思考与探究思考与探

23、究1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：元件的主要理由是：（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；子才能比较有利于基因的表达；（2） 通过通过cDNA文库获

24、得的目的基因没有启动子，只将编码序列导文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；入受体生物中无法转录；（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；如增强子等；（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因，如绿色荧光蛋白基因等往往要加上可以标识存在部位的基因，如绿色荧光蛋白基因等 2、利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞、利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？，若要生产