第五章 PCRPPT

1、聚合酶链式反应（PCR）第五章一、基因扩增 概念：指生物体内或体外人工方式使基因拷贝数大规模增加。有下列五种方式： 1. 环境诱发扩增 2. 基因的程序性扩增 3. 基因组进化扩增 4. 基因工程扩增 5. PCR扩增1.环境诱发扩增 在环境因子的诱发下，某些基因产生明显的扩增。如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。2. 基因的程序性扩增 在发育的某个阶段，某些基因的大量扩增。如非洲爪蟾卵子形成过程中rRNA基因的扩增。3. 基因组进化扩增 生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的基因聚集成簇。4. 基因工程扩增 载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制。5. PCR扩增 应用聚合酶

2、链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，在体外特异性地扩增某个基因。二、PCR技术Polymerase Chain Reaction1. PCR的发明（1）1971年Khorana提出体外人工复制DNA的设想。当时由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术都没有解决，设想未能实现。（2）1985年Cetus公司的科学家K.B. Mullis发明了PCR，使这一设想变成现实。Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。（3）Taq DNA 聚合酶 1988年 R.K. Saiki 把Taq DNA聚合酶用到PCR反应中。使 PCR自动循环仪成为可能。（4）PCR

3、仪 1988年 Cetus公司发明自动热循环仪。1986年 H.A. Erilish从嗜热 水生菌分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37 )，PCR技术才进入实用阶段。2. PCR技术的原理：（1）DNA模板变性 双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。（2）DNA模板与引物复性 引物（primer）:人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5端相同。40-65（3）DNA链的延伸 DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。72（4）1个循环的结果 （5）新一轮循环开始：变性复性延伸。理论上

4、30次循环3. PCR的过程（1）第一步：变性（denature） 94-95下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。（2）第二步：复性（anneal） 50-60 下1分钟，引物优先与模板复性。 引物的浓度高， 引物的链短。（3）第三步：延伸（extend） 72 下1-2分钟，Taq DNA聚合酶在引物的3端上加上核苷酸。（4）第四步：变性（denature） 94 下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。（5）第五步：重复（repeat）30-35个温度循环4. PCR的特点（1）特异性强 PCR使用专门合成的DNA引物。 延伸过程是在高温下进行。这就避免了一般DNA聚合酶污染和非

5、引物延伸形成的DNA。提高了反映的特异性。（2）敏感性高：需要模板量极低，理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109（3）快速：整个PCR过程约2-3小时即可完成。（4）简便：对模板的纯度要求低。不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。（5）可以扩增mRNA （RT-PCR） 先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。5. 影响 PCR的因素（1）Taq DNA聚合酶自从H.A. Erilish分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37 )，PCR技术才进入实用阶段。 热稳定性Taq DNA

6、聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。 最适温度高最适温度： 75-80 延伸速度： 约35-150nt/s.酶分子 最长延伸长度：6.7kb Taq酶的功能缺点 具有53聚合酶活性和53外切酶活性，但没有35外切酶活性。 因此不能修复错误的碱基配对！合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。 Taq DNA聚合酶的激活剂 金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。50mmol/L KCl也能激活Taq DNA聚合酶的活性。（2

7、）其它耐热的 DNA聚合酶 Tth DNA聚合酶 无3 5DNA外切酶活性，但高温下能逆转录cDNA，又能扩增DNA。VENT DNA聚合酶 有35外切酶活性，能够校正碱基的错配。能耐受100高温。 Pfu DNA Polymerase 有3 -5的外切酶活性，5-3外切酶活性。是目前已发现的所有耐高温DNA 聚合酶中出错率最低的。但PCR产物为平端！ Taq Plus DNA Polymerase 是Taq和Pfu DNA聚合酶的混合物。 Taq的PCR产物3端往往带有一个A。 （3）引物（primer)位置：与待扩增的模板DNA区段的两3端序列互补（ 5端相同）的短DNA。引物的长度 理论

8、计算：419=2.751011。即2.751011 bp的基因组中有一次完全与19个核苷酸的序列相同的机会。一般引物设计为长1530bp。引物的碱基序列 3端必须与模板正确配对，5端可以不配对。5端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。 引物的碱基组成1）尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力2）避免连续相同碱基排列或内部回文序列.3）避免形成引物二聚体（dimer） 两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。引物的Tm值 手工计算：Tm=（G+C)4 + (A+T)2 一般估计：当引物中的（G+C）含量低于50%时，复

9、性温度低于55。实际复性温度选择低于Tm值5。适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。引物的浓度 一般使用终浓度各0.5mol/L。简并引物 如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。套嵌引物（nested primers) 设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。引物设计现在多用专业软件如Primer5.0等（4）模板（template) 纯度：PCR对模板DNA的纯度要求不高。但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+

10、的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。 模板的量：不能太多，100l反应体系中100ng足够。（5）dNTPs dNTPs 是 dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。一般反应体系中dNTP混合液浓度2.5mM each。浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性并增加错配率。（6）Mg 2+ 的浓度 Taq DNA聚合酶要求有游离的Mg2+ 。所以Mg2+浓度不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带）。一般用1.5-4.5mmol/L的MgCl2终浓度。6. PCR技术的扩展（1）荧光实时定量PCR (Real-time PCR（或TaqMan PCR ）) 实时荧光定量PCR技术是一种较新的

11、DNA定量方法，其定量的基本原理是在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如SYBR GREEN I）或特异性的荧光探针（如Taqman探针），实时检测荧光的变化，获得不同样品达到一定荧光信号（阈值）时所需的循环次数CT值（Cycle Thresholg）:通过将已知浓度标准品的CT值与其浓度的对数绘制标准曲线，就可以准确定量被测样品的浓度。Ct值：样品到达域值水平所经历的循环数。 荧光探针和荧光染料荧光探针和荧光染料 实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。

12、前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。 SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料。与双链 DNA 结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。 SYBR Green I 在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链 DNA 相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。由于 SYBR Green I 与所有的双链 DNA 相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。 实时荧光定量 PCR 技术是 DNA 定量技术的一次飞跃。运用该项技术，我们可以

13、对 DNA、RNA 样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外我们还可以对 PCR 产物或样品进行定性分析：例如 利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体，以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析。 目前 实时荧光 PCR 技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。 （2）反向PCR 扩增两个引物外侧的未知序列 技术关键：把线性DNA模板转变成环形分子。使引物的外侧序列 “转变” 成内侧序列。（3）不对称PCR 用于扩增单链DNA，

14、单链DNA更适于测序。 技术关键：两个引物的浓度相差100倍。低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链DNA。最后产物中99%是单链DNA。（4）反转录PCR（RT-PCR) 扩增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。 技术关键：利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。7. PCR技术的应用（1）扩增某一段DNA 从基因组中扩增；从载体上扩增；组织样本原位扩增；微量残留DNA扩增；分析模板序列；（2）基因的体外诱变 在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。 技术关键：利用引物的5端序列不要求与模板严格配对，设计引物时

15、引入突变序列。（3）基因组的比较研究 比较不同物种之间的基因组特征和相似性。 RAPD (Random amplified polymorphism DNA) 利用6bp长度的随机序列引物扩增细胞中的总DNA，将会得到许多非特异性产物，反映了该引物序列在基因组中的分布状况。 类似于限制性内切酶片断长度多态性（RFLP）分析，因而也称为随机扩增多态性DNA（RAPD）分析。引物设计原则引物设计原则 1.引物长度： 一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。2.碱基分布的均衡性： 同一碱基连续出现不应超过5个，GC含量一般40-60

16、%，GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性，GC含量太高也易于引发非特异扩增。 3.引物自身 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。 4.引物之间 引物自身不能有连续4个碱基的互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补。两引物之间不应不互补性，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。同一引物之间也避免互补，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。 5.引物Tm值一般要求：55-65。 计算：对于低于20个碱基的引物，

17、Tm值可根据Tm=4(G C) 2(A T)来粗略估算，对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。Tm = H/( S R * ln (C/4) 16.6 log (K /(1 0.7 K ) - 273.156.引物二级结构 尽可能避免两个引物分子之间3端有有较多碱基互补。发夹结构尤其是要避免引物3端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。7.引物3端 引物的延伸从3端开始，因此3端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。8.引物5端 引物5端可以有与模板DNA不配对碱基，在5端引入一段非模板依赖性序列。5端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5端加上适当数量的保护碱基）。5端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。5端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。 9. 引物的内部稳定性 过去认为，引物3端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故3端最好