03 20110硕士分生实验——回收连接 2011.11 (袁野)

1、基因工程的基本过程基因工程的基本过程2DNA片段片段的的分离纯化分离纯化3v制胶制胶v点样点样v电泳分离电泳分离v回收片段回收片段v沉淀沉淀DNA。操作步骤操作步骤: :4载体载体 DNA目的目的基因基因5实验原理实验原理526取上清，用氯仿抽取上清，用氯仿抽提后，用乙醇沉淀，提后，用乙醇沉淀，70乙醇洗涤乙醇洗涤实验步骤实验步骤加中性酚加中性酚547酚抽提法酚抽提法 切下含目的切下含目的DNA的胶块。的胶块。 加入酚，将胶块没过即可。加入酚，将胶块没过即可。 振荡后低温冻结，视温度而定时间。振荡后低温冻结，视温度而定时间。 30水浴融化，若体积小，可补加水浴融化，若体积小，可补加TE。 振荡

2、器上振荡。振荡器上振荡。 12,000 rpm离心离心5 min。 取上清取上清200 l l。8 用用200 200 l l的氯仿：异戊醇抽提（振荡，离心的氯仿：异戊醇抽提（振荡，离心12000 rpm12000 rpm，5 min5 min，取上清，取上清150ul150ul）。）。 加加15 15 l NaAc NaAc，300 300 l l无水乙醇沉淀无水乙醇沉淀DNADNA，冰冻，冰冻约约30 min30 min甚至过夜。甚至过夜。 12,000 rpm12,000 rpm离心离心10 min10 min，弃上清。，弃上清。 将将DNADNA溶于约溶于约30 30 l l TE T

3、E中。中。9注意事项注意事项5510三、三、DNA片段回收及纯化片段回收及纯化vDEAE纤维素膜的电泳回收方法：纤维素膜的电泳回收方法：紧靠目的紧靠目的DNA片段前方切一裂隙，将一条片段前方切一裂隙，将一条DEAE纤维素膜插入纤维素膜插入裂隙中，继续电泳直至条带中所有的裂隙中，继续电泳直至条带中所有的DNA均收集均收集到膜上，然后从裂隙取出膜，用低离子强度的缓到膜上，然后从裂隙取出膜，用低离子强度的缓冲液洗掉污染物，最后在高离子强度的缓冲液中冲液洗掉污染物，最后在高离子强度的缓冲液中将将DNA洗脱下来。此方法简单，可同时用于许多洗脱下来。此方法简单，可同时用于许多片段，且获得的片段，且获得的D

4、NA极纯，但仅适用于小片段极纯，但仅适用于小片段DNA（15Kb的的DNA片段和单链片段和单链DNA不不适合，因难以洗脱下来。适合，因难以洗脱下来。11三、DNA片段回收及纯化v透析袋电洗脱法：透析袋电洗脱法：将含有将含有DNADNA片段的凝胶切下置于充片段的凝胶切下置于充满满1xTAE1xTAE的透析袋中，使凝胶块沉下，去掉大部分缓的透析袋中，使凝胶块沉下，去掉大部分缓冲液，在凝胶上方夹紧透析袋，不留气泡，将透析袋冲液，在凝胶上方夹紧透析袋，不留气泡，将透析袋浸泡在浸泡在1xTAE1xTAE电泳槽中，电泳电泳槽中，电泳2-32-3小时，使小时，使DNADNA从凝胶从凝胶中电洗脱下来。此法可以

5、回收大小范围较宽的中电洗脱下来。此法可以回收大小范围较宽的DNADNA，但很不方便。但很不方便。v从低溶点琼脂糖凝胶中回收从低溶点琼脂糖凝胶中回收DNADNA：琼脂糖的糖链上引琼脂糖的糖链上引入了羟乙基，在入了羟乙基，在30300 0C C左右成胶，大约在左右成胶，大约在65650 0C C熔化，在熔化，在大多数双链大多数双链DNADNA熔点温度以下。熔点温度以下。v采用挖槽法采用挖槽法v酚冻法酚冻法v试剂盒过柱法试剂盒过柱法12DNA片段的连接反应片段的连接反应13 DNA 连接酶连接酶 ligase 催化催化DNA 5 DNA 5 磷酸基与磷酸基与 3 3 羟基之间形羟基之间形成磷酸二酯键

6、成磷酸二酯键(ATP)(ATP)5533OH POHPDNA连接酶连接酶DNA连接酶连接酶14v单位：单位：在在10 l的连接反应体系中，的连接反应体系中，3 g的的DNA-Hind III的分解物在的分解物在16下反应下反应30分钟分钟时，有时，有90%以上的以上的DNA片段被连接所需要的片段被连接所需要的酶量定义为酶量定义为1个活性单位（个活性单位（U）。而它的浓度）。而它的浓度为为350 U/l ，所以完全够用。连接酶容易失，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。活，注意低温操作，最好在冰上。 15总体积总体积10 l 载体载体 0.10.2g目的基因：载体目的基因：载

7、体mol数数= 13：1H2O10buffer载体载体(3kb)目的基因目的基因(500bp)ligase总体积总体积10l .l 1l 0.1g .l 1l 16连接温度连接温度6217连接应注意的事项：连接应注意的事项： 目的基因与载体的目的基因与载体的mol数之比数之比 13 :1 连接酶的连接酶的buffer：溶解充分，分装，防止：溶解充分，分装，防止ATP降解降解 温度：温度：16最好？最好？ DNA的纯度的纯度18（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接1. 1. 粘性末端连接粘性末端连接 方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位

8、点连接不同限制酶切位点连接 配伍末端连接配伍末端连接 非配伍末端连接非配伍末端连接19Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连

9、目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接20不同限制酶切位点（配伍末端）的连接不同限制酶切位点（配伍末端）的连接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体 配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。212.

10、 平端连接平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端22目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连233. 同聚物加尾连接同聚物加尾连接 在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的作的作用下，在用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。造出粘性末端，再进行粘端连接。245 3 3 5 载体载体DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体254. 4. 人工接头人工接头(linker)连接：连接： 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除