蛋白酶的检测方法

1、蛋白酶活力测定法 ZB X 66030-87中华人民共和国专业标准 中华人民共和国专业标准蛋 白 酶 活 力 测 定 法 ZB X 66030-87Measurement of proteinase activity本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)

2、50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之。冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No45)过滤,置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。1.1.2 0.4mol碳酸钠溶液: 称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,定容至1000mL。1.1.3 0.4mol三氯乙酸(T C A)溶液: 称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL。1.1.4 pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,

3、定容至1000mL,即成0.2mol溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(B液)。取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。1.1.5 2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10mL,在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。1.1.6 100g/mL酪氨酸溶液:精确称取在105烘箱中烘至恒重的酪氨酸0

4、.1000g,逐步加入6mL 1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000g/mL,再吸取此液10mL,以0.2N盐酸定容至100mL,即配成100g/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。1.2 仪器a. 分析天平: 感量0.1mg;b. 581-G型光电比色计或72型分光光度计;c. 水浴锅;d. 1、2、5、10mL移液管等。1.3 操作1.3.1 标准曲线的绘制1.3.1.1 按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表1)。表 1 配制各种不同浓度的酪氨酸溶液 管 号 试 剂 1 2 3 4 5 6 蒸馏水,

5、mL 10 8 6 4 2 0100g/mL酪氨酸,mL 0 2 4 6 8 10酪氨酸最终浓度,g/ml 0 20 40 60 80 1001.3.1.2 测定步骤:取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1mL,各加入0.4mol碳酸钠5mL,再各加入已稀释的福林试剂1mL。摇匀置于水浴锅中。40保温发色20min在581-G型光电比色计上分别测定光密度(OD) (滤色片用65*#)或用72型分光光度计进行测定(波长660nm)。一般测三次,取平均值。将16号管所测得的光密度(OD)减去1号管(蒸馏水空白试验)所测得的光密度为净OD数。为了清楚起见。再列出表格如下 (表2)。表 2 管

6、号试 剂   1 2 3 4 5 6 按表1制备的不同浓度酪氨酸,mL 1 1 1 1 1 1 0.4mol/L Na2CO3,mL 5 5 5 5 5 5福林试剂,mL 1 1 1 1 1 1 1 2 O D值 3 平均 净O D值 0 以净O D值为横坐标,酪氨酸的浓度为纵坐标,绘制成标准曲线(或可求出每度OD所相当的酪氨酸量K)。1.3.2 样品稀释液的制备。1.3.2.1 测定酶制剂: 称取酶粉0.100g,加入pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL,吸取此液5mL,再用缓冲液稀释至25mL,即成5000倍的酶粉稀释液。1.3.2.2 测定成曲酶: 称取充

7、分研细的成曲5g,加水至100mL,在40水浴内间断搅拌1h,过滤,滤液用0.1mol pH 7.2磷酸盐缓冲液稀释到一定倍数(估计酶活力而定)。1.3.3 样品测定: 取15×100mm试管3支,编号1、2、3(做2只也可),每管内加入样品稀释液1mL,置于40水浴中预热2min,再各加入经同样预热的酪蛋白1mL,精确保温10min,时间到后,立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL,以终止反应,继续置于水浴中保温20min,使残余蛋白质沉淀后离心或过滤,然后另取15×150mm试管3支,编号1、2、3,每管内加入滤液1mL,再加0.4mol碳酸钠5mL,已稀释的福林试剂1

8、mL,摇匀,40保温发色20min后进行光密度(OD)测定。空白试验也取试管3支,编号(1)、(2)、(3),测定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加0.4mol三氯乙酸2mL,使酶失活,再加入酪蛋白。为了清楚起见,分别列出表格于下 (见表3及表4)。表 3 管 号 试 剂 管 号试 剂 1 2 3 (1) (2) (3)预热酶液, mL 1 1 1 预热酶液, mL 1 1 1预热2%酪蛋白, mL 1 1 1 0.4mol三氯乙酸, mL 2 2 2作用10min (精确计时) 作用10min (精确计时) 0.4mol三氯乙酸, mL 2 2 2 预热2%酪蛋白, mL 1 1 1表 4 管

9、号试 剂 1 2 3 (1) (2) (3) 滤 液, mL 1 1 1 1 1 10.4mol Na2CO3,mL 5 5 5 5 5 5福林试剂, mL 1 1 1 1 1 1 O D值 平均O D值 净O D值 0样品的平均光密度(O D)一空白的平均光密度(OD)=净OD值。1.4 计算在40下每分钟水解酪蛋白产生1g酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。A 1样品蛋白酶活力单位(干基)=×4×N× (1)10 1 - W式中:A由样品测得OD值,查标准曲线得相当的酪氨酸微克数(或OD值×K);44毫升反应液取出1 mL测定 (即

10、4倍);N酶液稀释的倍数;10反应10min;W样品水分百分含量。1.5 注意事项以上介绍的方法用于测定中性蛋白酶(pH7.2)。若要测定酸性蛋白酶或碱性蛋白酶,则把配制酪蛋白溶液和稀释酶液用的pH缓冲液换成相应pH缓冲液即可。现把几种常用pH缓冲液配方提供如下:1.5.1 pH7.5磷酸盐缓冲液 (0.02mol/L)称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氢钠 (NaH2PO4·2H2O)0.5g以蒸馏水溶解定容至1000mL。1.5.2 pH 2.5乳酸-乳酸钠缓冲液 (0.05mol)A 液: 称取80%90%乳酸10.6g,加蒸馏水稀释定容至

11、1000mL。B 液: 称取70%乳酸钠16g,加水稀释定容至1000mL。取A 液16mL与B 液1mL混合稀释一倍即成。1.5.3 pH 3.0乳酸-乳酸钠缓冲液 (0.05mol)A 液: 称取80%90%乳酸10.6g,以水定容至1000mL。B 液: 称取70%乳酸钠16g,蒸馏水溶解定容至1000mL。取A 液8mL与B 液1mL,混合稀释一倍即成。1.5.4 pH 10硼砂-氢氧化钠缓冲液A 液: 称取硼砂19.08g,用蒸馏水溶解定容至1000mL (0.05mol)。B 液: 称取氢氧化钠8g,用蒸馏水溶解定容至1000mL (0.2N)。取A 液250mL,B 液215mL

12、混合,用蒸馏水稀释定容至1000mL即成。1.5.5 pH 11.0硼砂-氢氧化钠缓冲液A 液: 称取硼砂19.08g,用蒸馏水定容至1000mL 。B 液: 称取氢氧化钠4g,用蒸馏水定容至1000mL 。取A 液与B 液等量混合。1.5.6 2%酪蛋白溶液配成酸性时,须先加数滴浓乳酸,使之湿润以加速其溶解。2 甲醛法成曲蛋白酶活力的测定,如用福林法测定确有困难时,可用甲醛法测定作过渡。2.1 仪器a. 分析天平:感量0.01g;b. 水浴锅;c. 电烘箱;d. 容量瓶、吸管、滴定管等。2.2 试剂与溶液a. 1%酚酞指示剂;b. 0.1%麝香草酚蓝;c. 0.1N氢氧化钠液、甲醛(试剂配制

13、法同氨基态氮的测定,见ZB X 6603887氨基态氮测定法)。2.3 操作2.3.1 目测法称取研细均匀的成曲样品10g,放入250mL锥形瓶中,加55温水80mL,充分摇匀,置于55水浴锅中保温3h,取出后加热煮沸以破坏酶活力,冷却后定容至100mL,充分摇匀后以脱脂棉过滤,吸取滤液10mL,移至150mL锥形瓶中,加水50mL, 1%酚酞指示剂0.2mL,以0.1N氢氧化钠标准溶液滴定至刚显微红色(pH 8.2),记下滴定数作为总酸,继续加甲醛10mL,用0.1N氢氧化钠液滴定至深红色(pH 8.5)为终点,若再加麝香草酚蓝1mL作指示剂,则滴至紫红色为终点。记下滴定数,减去空白数后计算

14、成氨基态氮。另称取曲10g做水分,再折算成干基数。2.3.2 酸度计法所用仪器、药品、操作方法等与氨基态氮测定法同 (见 ZB X 66038-87)。2.4 计算蛋白酶活力 (克氨基态氮/100g)(干基)(V-*Vo)×N×0.014 100=× (2)10 1 -W10×100式中:V加入甲醛后氢氧化钠标准液滴定数, mL;*Vo甲醛空白滴定数, mL;W曲水分,%;N氢氧化钠标准溶液的当量数,N;0.014氮的毫克当量数。附加说明:本标准由商业部副食品局提出。本标准由上海市酿造科学研究所起草。本标准主要起草人须凤高。*本法实质上是在一定温度下、一

15、定时间内,成曲利用自身的蛋白酶把自身原料中的蛋白质水解成氨基酸。以测定氨基态氮的量来衡量蛋白酶活力的数值。在培养和堆放过程,环境温度和自身含有水分,故已有少量氨基酸生成。为了能和福林法的酶活力进行对照,可用空白试验以扣除此误差,方法是另取一曲样于开始时即将成曲酶活杀灭,其余操作步骤完全相同。杀酶的方法是把已煮沸的蒸馏水70mL倾入10g成曲中,并马上继续把成曲液煮沸几分钟,其余操作与样品同,成曲和甲醛的空白一起算成Vo。胰蛋白酶活性测定 在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca2+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽

16、链 N -端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。 胰蛋白酶原分子量约为24 000，其等电点为pH8.9；胰蛋白酶的分子量约为23 400，其等电点为pH 10.8。 胰蛋白酶在pH3.0时最稳定，其浓溶液可贮存于冰箱（0以下）数周而活性无显著丧失。pH3时，胰蛋白酶易变性。 PH时，胰蛋白酶易自溶。胰蛋白酶催化活性的最适pH为7.67.8。 重金属离子、有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。胰脏、卵清和大豆中也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性

17、具有抑制作用。原理胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。此外，胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酰胺键和酯键，有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择对此等化学键的催化水解活性的敏感度为：酯键酰胺键肽键。因此，可以利用含有这些化学键中任一种键型的底物来研究胰蛋白酶的专一催化活性。本实验方法一采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE），N-benzoyl-L-arginine ethyl ester作为底物，水解反应如下：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）在波长253nm下的紫外光吸收远远弱于N-

18、苯甲酰-L-精氨酸（BA），benzoyl-L-arginine的紫外光吸收。在胰蛋白酶的催化下，BAEE随着酯键的水解，水解产物 BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，以A253nm计算胰蛋白酶的活性。 胰蛋白酶的BAEE单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使A253nm增加0.001的酶量为一个BAEE单位。 本实验方法二采用以酪蛋白为底物的方法来测定胰蛋白酶活性。以酪蛋白为底物，主要用于测定胰蛋白酶粗制品的活力。胰蛋白酶催化水解底物酪蛋白生成不被三氯醋酸沉淀的小分子肽以及氨基酸。在一定浓度范围内，酶的水解滤液在波长275nm处光吸收的增值与胰蛋白酶

19、的活力单位成正比。测定中以标准酪氨酸溶液的光吸收作对照，根据活力单位的定义，确定样品中胰蛋白酶的活性。活力单位的定义：在一定条件下，每分钟酶水解滤液光吸收的增值与1mol酪氨酸在275nm 处光吸收值相同时的酶量为一个蛋白酶活力单位（U）。 试剂和器材 1、试剂 （1）1.0mmol/L BAEE底物溶液 （2）10mmol/L HCl （3）0.1mol/L、pH8.0硼酸盐缓冲液 （4）10mg/m酪蛋白溶液 取酪蛋白1g，加13mL 0.1mol/L NaOH、蒸馏水40mL，置60水浴加热至溶解，放至室温后，加水稀释调pH至8.0并定容

20、至100mL。 （5）5% 三氯乙酸溶液 （6）0.2mol/L盐酸溶液 （7）50g/mL酪蛋白对照溶液 精确称取经105干燥至恒重的酪氨酸5mg，用0.2mol/L盐酸定容至100mL。 （8）胰蛋白酶样液 2、器材 （1）恒温水浴 （2）紫外分光光度计 （3）离心机 （4）试管 方法和步骤 1、N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）测定法： 取2个光程为1cm的带盖石英比色杯，分别加入25预热过的2.8mL 1.0mmol/L BAEE底物溶液。向一个比色杯内加入0.2mL10mmol/L HCl，作为空白，在波长253nm下调节仪器零点；向另一个比色杯中加入0.2mL待测酶液，立即盖上盖迅速混匀计时，每半分钟读数一次，共读34min。测得的结果要使A253nm/min控制在0.050.100之间为宜。若偏离此范围则要适当增减酶量。 以时间（t）为横坐标，光吸收值（ A253nm）为纵坐标作图，在直线部分任选一个时间间隔与相应的光吸收值变化（A253nm），按以下公式计算胰蛋白酶的活力单位。2、酪蛋白为底物测定法 （1）取3支试管，13编号。 取