细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)(精品文档)_共4页

1、迁移实验（ cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜 相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。实验步骤：1 材料准备：可拍照显微镜， Transwell 小室，孔径8m，没包被胶的 (Coster 和 Corning公司的也较常用)， Transwell 迁移实验的细胞培养板24 孔板。细胞培养板应当与购买的Trans

2、well 小室相配套， BD 公司的 Matrigel ，无血清 DMEM ，(1% 胎牛血清 )DMEM 和 1640 培养基，DMEM 完全培养基，1640 完全培养基（也可加到20% 血清），无菌 PBS ，棉签，胰酶，4% 多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1% （ g/ml ）PBS 结晶紫）2 步骤和流程2.1 基质胶铺板：用 BD 公司的 Matrigel1 ：8（根据细胞产生mmp 的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37 30min 使 Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。2.2 制备细胞悬液制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12

3、 24h ，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用 PBS 洗 1 2 遍），用含 BSA 的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml 。2.3 接种细胞取细胞悬液100l加入 Transwell小室。 24 孔板下室一般加入 600l含 20%FBS 的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。培养细胞：常规培养 12 48h （主要依癌细胞侵袭能力而定） 。 24h 较常见，时间点

4、的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。2.4 结果统计直接计数法， “贴壁 ”细胞计数，这里所谓的“贴壁 ”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。取出 Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS 洗 2 遍，甲醇固定30 分钟，将小室适当风干。0.1% 结晶紫染色20 min ，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS 洗 3 遍。400 倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。实验材料本文档下载后根据实际情况可编辑修改使用（ 1） Transwell chamber: 24-well,8.0-

5、m pore membranes (Corning)（ 2）细胞培养相关试剂：无血清培养基，10血清培养基， PBS，0.02 EDTA（ 3）固定液：甲醇（ 4）染色液： Giemsa染液（ 5）封片剂：中性树胶（ 6）其他：小镊子，棉棒，载玻片，盖玻片操作步骤（ 1）所有细胞培养试剂和 Transwell chamber 放在 37温育；（ 2）待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用 PBS和无血清培养基先后洗涤一次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为2×105 /ml ；（ 3）在下室（即 24 孔板底部）加入 600800l 含 10血清的培养基，上室加入 100150

6、l细胞悬液，继续在孵箱培养 24 小时；（ 4）用镊子小心取出 chamber，吸干上室液体，移到预先加入约 800l甲醇的孔中，室温固定 30 分钟；（ 5）取出 chamber，吸干上室固定液，移到预先加入约 800l Giemsa染液的孔中，室温染色 1530 分钟；（ 6）轻轻用清水冲洗浸泡数次，取出 chamber，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞；（ 7）用小镊子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至载玻片上用中性树胶封片；（ 8）显微镜下取 9 个随机视野计数，统计结果。注意事项（ 1）根据待测细胞体积大小选择合适孔径的 chamber。常用的为 8.0- m孔径（如

7、 AGS细胞），如果细胞体积较大可以考虑用 10-m孔径；（ 2）根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数和迁移时间。常规24-well chamber 接种细胞数约为 25×10 4/well ，迁移时间 1236 小时；（ 3）由于 Corning 公司的 24-Transwell 内含 12 个独立的 chamber，为了避免操作污染，每次实验可预先另准备一块24 孔普通培养板（ Corning ）；（ 4）如果细胞迁移能力较弱，下室液体可用3T3 细胞无血清培养 24 小时获得的上清加 50g/ml FN（ Fibronectin），具体可查阅相关文献；（ 5）细胞悬液加入膜中央

8、，尽量保证液面水平；（ 6）固定染色擦洗时动作小心，避免擦去膜底面的细胞。但一定要充分擦净膜表面上未迁移的细胞，以免影响读数。尤其是膜周边上可用细牙签或小镊子缠上湿棉花擦洗，但要小心避免将膜戳破；本文档下载后根据实际情况可编辑修改使用（ 7） Chamber和膜上都无法标记，操作时应小心避免混淆实验组和对照组；（ 8）充分晾干，避免残留水分导致镜下聚焦不一致。细胞侵袭实验（cell invasion assay）实验材料（ 1） Matrigel (BD 5mg/ml)，-20保存（ 2）其余材料同迁移实验操作步骤（ 1） Matrigel 在 4过夜融化；（ 2）用 4预冷的无血清培养基稀释

9、 Matrigel 至终浓度 1mg/ml，冰上操作；（ 3）在 chamber 上室底部中央垂直加入 100l稀释后的 Matrigel ，37温育4 5 小时使其干成胶状；（ 4）后续步骤同迁移实验（ 1-8 ）。注意事项（ 1） Matrigel 在过高或过低的温度均易凝固，因此操作所需枪头和离心管应提前在 4预冷；（ 2）铺胶时保证液面水平，胶的厚度均匀一致，切勿产生气泡；（ 3）其他注意事项同迁移试验。其他Transwell做肿瘤侵袭实验的具体步骤(1)基质胶准备：将冻存于 80度冰箱的 BD matrigel 4 度过夜（ 24h ），变成液态；（2）取 300ul 无血清培养基，

10、加入60ul （或 50ug/ 每室） Matrigel ，混匀，（ 4操作，最好在冰浴上） ，加入上室各100ul （ 3 个室）；放入 37培养箱中，孵育 4-5h （>5h ）；此间经常观察，当出现“白色层 ”时，说明已经变为固态。注释：无血清培养基和基质胶按1：5 稀释，每孔加 50ul ，在 37培养箱中 1-2h 。（3）消化细胞，无血清培养基洗3 次，计数，配成细胞悬液；（ 4）用无血清培养基洗 Matrigel 洗 1 次；每孔加入 100ul 细胞悬液；（ 5）下腔室中加入 500ul 含有 20 FBS 条件培养基；（ 6） 37 培养箱中，孵育 20-24h ；（

11、7）取出 transwell 用 PBS 洗 2 遍， 5% 戊二醛固定， 4；（ 8）加入结晶紫（ 0.1% ）染色或 Giemsa 染色（ 5 10min ），室温 0.5h ， PBS 洗 2遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察。迁移实验本文档下载后根据实际情况可编辑修改使用transwell在 24 孔板中浸泡 1小时；消化细胞，无血清培养基洗 2次，计数，配成细胞悬液，每孔加入 100ul 细胞悬液；加药刺激；下腔室中加入条件培养基或其他刺激因子； 37培养箱中，孵育20-24h ；取出transwell 用 PBS洗 2 遍，5% 戊二醛固定， 4； PBS 洗 2 遍，加入结晶

12、紫（ 0.1% ）染色，室温0.5h ，PBS 洗 2遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察计数10照相，记录。侵袭实验取 300ul无血清培养基，加入 30ul （或 50ug/ 每室） Matrigel，混匀，（ 4 操作，最好在冰浴上） ，加入上室各 100ul（3 个室）； 放入 37 培养箱中，孵育 4-5h（ >5h）； 消化细胞，无血清培养基洗3次，计数，配成细胞悬液；用无血清培养基洗Matrigel洗1 次；每孔加入100ul细胞悬液；下腔室中加入600ul无血清 条件培养基； 37 培养箱中，孵育20-24h；取出transwell用 PBS洗 2遍， 5%戊二醛固定，4 ；PBS 洗 2遍，加入结晶紫（0.1%）染色，