细胞产物分析技术-5质谱分析

1、Mass Spectrometry Technologies 概述概述 质谱仪的工作原理质谱仪的工作原理 质谱仪种类质谱仪种类 色谱质谱联用色谱质谱联用 GC-MS联用联用 LC-MS联用联用 应用示例应用示例气体分子或固体、液体的蒸气受到一定能量的电子流气体分子或固体、液体的蒸气受到一定能量的电子流轰击或强电场作用，丢失价电子生成分子离子；同时，轰击或强电场作用，丢失价电子生成分子离子；同时，化学键也发生某些有规律裂解，生成各种碎片离子。化学键也发生某些有规律裂解，生成各种碎片离子。这些带正电荷的离子在电场和磁场的作用下，按质荷这些带正电荷的离子在电场和磁场的作用下，按质荷比（即质量与电荷比

2、值比（即质量与电荷比值 m/z） 的大小分开，排列成的大小分开，排列成谱，记录谱，记录下来即为下来即为质谱质谱（Mass Spectroscopy）。）。概述概述基本概念基本概念Linear Time Of Flight tubeReflector Time Of Flight tubedetectorreflectorion sourceion sourcedetectortime of flighttime of flight概述概述特点特点质谱是定性鉴定与研究分子结构的有效方法。质谱是定性鉴定与研究分子结构的有效方法。l 灵敏度高灵敏度高：绝对灵敏度可达绝对灵敏度可达5pg（pg为为10

3、-12g）l 样品用量少样品用量少：微克级：微克级l 分析速度快分析速度快：扫描：扫描1-1000u仅需仅需1/1000秒秒l 测定对象广测定对象广：气体、液体、室温下具有：气体、液体、室温下具有10-7Pa蒸汽蒸汽 压的固体压的固体概述概述用途用途l 求准确的分子量求准确的分子量 l 化学式的确定化学式的确定l 推测未知物的结构推测未知物的结构l 鉴定同分异构体鉴定同分异构体l 测定分子中测定分子中Cl、Br等的原子数等的原子数l 概述概述质谱的发展史质谱的发展史l1912年世界上第一台现代意义质谱仪在英国剑桥年世界上第一台现代意义质谱仪在英国剑桥Cavendish实实验室出现验室出现l19

4、18年世界上第一台实际意义质谱仪在美国芝加哥大学实验年世界上第一台实际意义质谱仪在美国芝加哥大学实验室出现室出现(扇型磁场扇型磁场MS)l1943年世界上第一台商业质谱仪年世界上第一台商业质谱仪l1953年四极杆质量分析器质谱仪年四极杆质量分析器质谱仪l1955年飞行时间质量分析器质谱仪年飞行时间质量分析器质谱仪l60s 开发开发GC/MSl60s-70s 大气压电离大气压电离(APcI)源被发现源被发现(但并未被广泛应用但并未被广泛应用)l70s-80s 开始广泛研究开始广泛研究LC/MSl1982年离子束年离子束LC/MS接口出现接口出现l1984年第一台电喷雾年第一台电喷雾MS仪宣告诞生

5、仪宣告诞生l1988年电喷雾离子源年电喷雾离子源MS 首次应用于蛋白质的分析首次应用于蛋白质的分析l.Joseph J. Thomson1906年诺贝年诺贝尔物理奖尔物理奖电荷在气体电荷在气体中的运动中的运动Francis William Aston1922年年诺贝诺贝尔化学奖尔化学奖质谱技术发质谱技术发现同位素现同位素Wolfgang Paul1989年诺贝年诺贝尔物理奖尔物理奖离子阱技术离子阱技术质谱的发展史质谱的发展史Hans G. Dehmelt1989年诺贝年诺贝尔物理奖尔物理奖离子阱技术离子阱技术年年Koichi Tanaka2002年诺贝年诺贝尔化学奖尔化学奖基质辅助激基质辅助激

6、光解吸电离光解吸电离方法方法John Bennet Fenn2002年诺贝年诺贝尔化学奖尔化学奖电喷雾离子电喷雾离子化化MALDI-TOF-TOF MS MALDI-TOF MSnanoESI Q-TOF MS4000 QTRAP MSl分子离子分子离子 Molecular IonMolecular Ion 试样分子失去或得到一个电子而形成的离子。它在试样分子失去或得到一个电子而形成的离子。它在正离子场合下表示为正离子场合下表示为M M 。它的质荷比即表明试样。它的质荷比即表明试样分子所对应的分子量数值。分子所对应的分子量数值。l母离子母离子 Parent Ion Parent Ion 产生某

7、一碎片的前体离子，母离子不一定是分子离产生某一碎片的前体离子，母离子不一定是分子离子。子。 l子离子子离子 Daughter Ion Daughter Ion 由母子离子裂解后形成的离子。由母子离子裂解后形成的离子。常见术语常见术语: :常见术语常见术语: :l质荷比质荷比: : 离子质量离子质量( (以相对原子量单位计以相对原子量单位计) )与它所带电荷与它所带电荷( (以以电子电量为单位计电子电量为单位计) )的比值的比值, ,写作写作m/Z.m/Z.l峰峰: : 质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰. .l离子丰度离子丰度: : 检测器检测到的

8、离子信号强度检测器检测到的离子信号强度. .质谱仪的工作原理质谱仪的工作原理即：即： 由分子结构与裂解方式的经验规律由分子结构与裂解方式的经验规律, ,根据分子根据分子离子和各种碎片离子的质荷比及其相对丰度离子和各种碎片离子的质荷比及其相对丰度, ,就就可以进行结构分析。可以进行结构分析。 有机分子有机分子电子轰击电子轰击质谱质谱裂解裂解碎片离子碎片离子分子离子分子离子( (- -e)e)(M)(M)( M )( M )+ +分离、收集、记录分离、收集、记录l分子离子化，它通过在分子离子化，它通过在离子源离子源中进行电子电中进行电子电离、快速原子离、快速原子/ /离子轰击、基体辅助激光解离子轰

9、击、基体辅助激光解吸或电喷雾来实现；吸或电喷雾来实现；l带电分子的离子及其碎片必须根据其质荷比带电分子的离子及其碎片必须根据其质荷比来得到分离，这往往在来得到分离，这往往在质量分析器质量分析器中进行；中进行；l最后，分离的带电荷的碎片必须通过最后，分离的带电荷的碎片必须通过检测器检测器检测。检测。真空系统真空系统l直接进样法直接进样法（静态法）：对纯的化合物来说，一（静态法）：对纯的化合物来说，一般为气体或挥发性液体，可直接进样到离子源室，般为气体或挥发性液体，可直接进样到离子源室，而不需要专用设备或器件，这类似于气相色谱中而不需要专用设备或器件，这类似于气相色谱中的样品进样。的样品进样。l直

10、接插入探针法直接插入探针法：对于挥发性很小的固体样品，：对于挥发性很小的固体样品，需将样品放在不锈钢杆或探针顶端的小杯内，将需将样品放在不锈钢杆或探针顶端的小杯内，将探针通过样品加入口放进离子源中，然后加热离探针通过样品加入口放进离子源中，然后加热离子源直至固体挥发。子源直至固体挥发。l动态平衡法动态平衡法（色谱进样）：对一些组分较复杂的（色谱进样）：对一些组分较复杂的混合物时，需将样品分离成一个个单一组分，再混合物时，需将样品分离成一个个单一组分，再进入质谱仪。最典型的就是气相或液相色谱通过进入质谱仪。最典型的就是气相或液相色谱通过接口与质谱连接。接口与质谱连接。进样系统进样系统在离子源中样

11、品被电离成离子，不同性质的样品可在离子源中样品被电离成离子，不同性质的样品可能需要不同的电离方式。能需要不同的电离方式。l电子轰击电离电子轰击电离（electron impact, EI)电子轰击电离使用具有一定能量的电子直接作用于电子轰击电离使用具有一定能量的电子直接作用于样品分子，使其电离。用钨或铼制作的灯丝在高真样品分子，使其电离。用钨或铼制作的灯丝在高真空中发射出电子。灯丝与电离盒之间的电压称为电空中发射出电子。灯丝与电离盒之间的电压称为电离电压。对有机化合物通常选用离电压。对有机化合物通常选用70eV的电压。的电压。离子源离子源l化学电离化学电离（Chemical ionizatio

12、n, CI)化学电离化学电离:是将样品气体和反应气体分子混合（其中是将样品气体和反应气体分子混合（其中样品含量约样品含量约0.1），进入电离室后，首先用电子轰），进入电离室后，首先用电子轰击方式使反应气体电离，然后反应气体与样品气体击方式使反应气体电离，然后反应气体与样品气体进行离子进行离子-分子反应而使样品气体电离，因此样品的分子反应而使样品气体电离，因此样品的离子是由离子离子是由离子-分子反应产生的。这样产生的离子能分子反应产生的。这样产生的离子能量较小，故碎片较少。量较小，故碎片较少。对于不稳定的有机化对于不稳定的有机化合物，可得到较强的合物，可得到较强的分子离子峰。分子离子峰。l大气压

13、化学电离大气压化学电离（atmospheric pressure chemical ionization, APCI)在大气压下，化学电离反应的速率更大，电离在大气压下，化学电离反应的速率更大，电离效率应更高。主要困难是将大气压力下产生的离效率应更高。主要困难是将大气压力下产生的离子转移到处于高真空（子转移到处于高真空（10-6Torr)状态的质量分状态的质量分析器中。现在常用的是电晕放电大气压电离。析器中。现在常用的是电晕放电大气压电离。l快原子轰击快原子轰击（Fast atom bombardment, FAB) 用加速的中性原子（快原子）撞击以甘油（底物）用加速的中性原子（快原子）撞击以

14、甘油（底物）调和后涂在金属表面的有机化合物（调和后涂在金属表面的有机化合物（“靶面靶面”），），导致这些有机化合物电离的方法称之为快原子轰击导致这些有机化合物电离的方法称之为快原子轰击（FAB）。）。由于快原子轰击是一种软电离技术，被由于快原子轰击是一种软电离技术，被分析样品不须经过气化而直接电离，所以，快原子分析样品不须经过气化而直接电离，所以，快原子轰击质谱法常用于分析极性强、不易气化和热稳定轰击质谱法常用于分析极性强、不易气化和热稳定性差的样品。性差的样品。l电喷雾电离（电喷雾电离（Electro spray ionization, ESI)原理：原理：不锈钢毛细管被加以不锈钢毛细管被加

15、以3-5kV的正电压，与相距的正电压，与相距约约1cm接地的反电极形成强静电场。被分析的样品溶接地的反电极形成强静电场。被分析的样品溶液从毛细管流出时在电场作用下形成高度荷电的雾状液从毛细管流出时在电场作用下形成高度荷电的雾状小液滴；在向质量分析器移动的过程中，液滴因溶剂小液滴；在向质量分析器移动的过程中，液滴因溶剂的挥发逐渐缩小，其表面上的电荷密度不断增大。当的挥发逐渐缩小，其表面上的电荷密度不断增大。当电荷之间的排斥力足以克服表面张力时，液滴发生裂电荷之间的排斥力足以克服表面张力时，液滴发生裂分；经过这样反复的溶剂挥发液滴裂分过程，最后分；经过这样反复的溶剂挥发液滴裂分过程，最后产生单个多

16、电荷离子。产生单个多电荷离子。电喷雾通常要选择合适的溶剂电喷雾通常要选择合适的溶剂。除了考虑对样品的溶。除了考虑对样品的溶解能力外，溶剂的极性也需考虑。一般来说，极性溶解能力外，溶剂的极性也需考虑。一般来说，极性溶剂（如甲醇、乙腈、丙酮等）更适合于电喷雾。剂（如甲醇、乙腈、丙酮等）更适合于电喷雾。电喷雾（电喷雾（ESI) 离子化过程离子化过程电喷雾离子化可分为三个过程电喷雾离子化可分为三个过程: :1 1、形成带电小液滴形成带电小液滴2 2、溶剂蒸发和小液滴碎裂溶剂蒸发和小液滴碎裂3 3、最终形成气相离子最终形成气相离子质量分析器质量分析器l质量分析器的作用是将离子源中形成的离子按质质量分析器

17、的作用是将离子源中形成的离子按质荷比的大小不同分开，质量分析器可分为静态分荷比的大小不同分开，质量分析器可分为静态分析器和动态分析器两类。析器和动态分析器两类。l静态分析器采用稳定不变的电磁场（电磁场随时静态分析器采用稳定不变的电磁场（电磁场随时间改变，只是为了记录质谱而不是分离原理所要间改变，只是为了记录质谱而不是分离原理所要求的），并且按照空间位置把不同质量（求的），并且按照空间位置把不同质量（m/em/e）的）的离子分开。属于这一类的仪器有单聚焦磁场分析离子分开。属于这一类的仪器有单聚焦磁场分析器和双聚焦磁场分析器。动态分析器采用变化的器和双聚焦磁场分析器。动态分析器采用变化的电磁场，按

18、照时间或空间来区分质量不同的离子。电磁场，按照时间或空间来区分质量不同的离子。属于这一类的仪器有飞行时间质谱仪、四极滤质属于这一类的仪器有飞行时间质谱仪、四极滤质器等。器等。四极杆质量分析器四极杆质量分析器由四根精密加工的电极杆以及分别施加于由四根精密加工的电极杆以及分别施加于x x、y y方向两组方向两组高压高频射频组成的电场分析器。高压高频信号提供了高压高频射频组成的电场分析器。高压高频信号提供了离子在分析器中运动的辅助能量，只有符合一定数学条离子在分析器中运动的辅助能量，只有符合一定数学条件的离子才能够不被无限制的加速，从而安全的通过四件的离子才能够不被无限制的加速，从而安全的通过四极杆

19、分析器。极杆分析器。 离子阱离子阱离子阱质谱与四极杆质谱同样利用了离子在射频离子阱质谱与四极杆质谱同样利用了离子在射频电场的运动特性。用高频交流电把离子限制在离电场的运动特性。用高频交流电把离子限制在离子阱里，然后用离子的特征电压分别将其推出离子阱里，然后用离子的特征电压分别将其推出离子阱，到检测器检测。离子阱质量分析器具有结子阱，到检测器检测。离子阱质量分析器具有结构简单和对真空度要求低等特点，因而成为制造构简单和对真空度要求低等特点，因而成为制造小型质谱仪的首选小型质谱仪的首选. . 飞行时间质谱飞行时间质谱这种质谱仪的质量分析器是一个这种质谱仪的质量分析器是一个离子离子漂移管，由离子漂移

20、管，由离子源产生的离子加速后进入无场漂移管，并以恒定速度源产生的离子加速后进入无场漂移管，并以恒定速度飞向离子飞向离子接收器接收器。离子质量越大，到达接收器所用时。离子质量越大，到达接收器所用时间越长，离子质量越小，到达接收器所用时间越短，间越长，离子质量越小，到达接收器所用时间越短，根据这一原理，可以把不同质量的离子按根据这一原理，可以把不同质量的离子按m/zm/z值大小值大小进行分离。进行分离。 真空系统真空系统l质谱仪器中凡有样品分子和离子的地方必须抽成质谱仪器中凡有样品分子和离子的地方必须抽成真空状态，即质谱仪的离子源、质量分析器及检真空状态，即质谱仪的离子源、质量分析器及检测系统都必

21、须处于真空状态下工作（一般为测系统都必须处于真空状态下工作（一般为1.33310-41.333 10-6Pa ）。质谱仪的真空系。质谱仪的真空系统要求残余气体中不能留有对测定不利的气体成统要求残余气体中不能留有对测定不利的气体成分，否则：空气中的氧会烧坏离子源的灯丝；会分，否则：空气中的氧会烧坏离子源的灯丝；会引起额外的离子分子反应，使质谱复杂化引起额外的离子分子反应，使质谱复杂化; ;且干且干扰离子源中电子束的正常调节，影响仪器的分辨扰离子源中电子束的正常调节，影响仪器的分辨率；真空度低会使本底增高，干扰质谱图。率；真空度低会使本底增高，干扰质谱图。质谱仪种类质谱仪种类l有机质谱仪有机质谱仪

22、： 气相色谱气相色谱-质谱联用仪质谱联用仪（GC-MS） 在这类仪器中，由于质谱仪工作原理不同，又有在这类仪器中，由于质谱仪工作原理不同，又有气相色谱气相色谱-四极质谱仪，气相色谱四极质谱仪，气相色谱-飞行时间质谱飞行时间质谱仪，气相色谱仪，气相色谱-离子阱质谱仪等。离子阱质谱仪等。 液相色谱液相色谱-质谱联用仪质谱联用仪（LC-MS）。）。 同样，有液相色谱同样，有液相色谱-四极质谱仪，液相色谱四极质谱仪，液相色谱-离子离子阱质谱仪，液相色谱阱质谱仪，液相色谱-飞行时间质谱仪，以及各种飞行时间质谱仪，以及各种各样的液相色谱各样的液相色谱-质谱质谱-质谱联用仪。质谱联用仪。 其他有机质谱仪其他

23、有机质谱仪 基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪（基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪（MALDI- TOF MS）；傅立叶变换质谱仪（）；傅立叶变换质谱仪（FT-MS）。）。质谱仪种类质谱仪种类l无机质谱仪无机质谱仪 包括：包括： 火花源双聚焦质谱仪。火花源双聚焦质谱仪。 感应耦合等离子体质谱仪（感应耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）。）。 二次离子质谱仪（二次离子质谱仪（SIMS）。）。l同位素质谱仪同位素质谱仪l气体分析质谱仪气体分析质谱仪 主要有呼气质谱仪，氦质谱检漏仪等。主要有呼气质谱仪，氦质谱检漏仪等。除上述分类外，还可以根据质谱仪所用质量分析器的除上述分类外，还可以根据质谱仪所用质量分析器的

24、不同，把质谱仪分为双聚焦质谱仪、四极杆质谱仪、不同，把质谱仪分为双聚焦质谱仪、四极杆质谱仪、飞行时间质谱仪、离子阱质谱仪、傅立叶变换质谱仪飞行时间质谱仪、离子阱质谱仪、傅立叶变换质谱仪等。等。质谱质谱：纯物质结构分析：纯物质结构分析色谱色谱：化合物分离：化合物分离色谱色谱- -质谱联用质谱联用：共同优点：共同优点GC-MSGC-MS；LC-MSLC-MS；CZE-MSCZE-MS困难点困难点：载气载气( (或流动液或流动液) )的分离；的分离；出峰时间监测；出峰时间监测；仪器小型化；仪器小型化；关键点：接口技术关键点：接口技术( (分子分分子分离器离器) )色谱质谱联用色谱质谱联用GC-MS

25、气质联用气质联用l要使气相色谱和质谱仪器联用，首先要解决的要使气相色谱和质谱仪器联用，首先要解决的问题是问题是气压问题气压问题。色谱柱出口压通常是常压，。色谱柱出口压通常是常压，而质谱仪在正常工作压力是高真空，故二者无而质谱仪在正常工作压力是高真空，故二者无法相接。必须采用一个连接器，用来除去载气，法相接。必须采用一个连接器，用来除去载气，以降低气相色谱流出物的气压并富集试样，以以降低气相色谱流出物的气压并富集试样，以达到质谱仪的工作要求。达到质谱仪的工作要求。l如果如果色谱仪使用填充柱色谱仪使用填充柱，必须经过一种接口装，必须经过一种接口装置置分子分离器，将色谱载气去除，使样品分子分离器，将

26、色谱载气去除，使样品气进入质谱仪；气进入质谱仪；l如果如果色谱仪使用毛细管柱色谱仪使用毛细管柱，则可以将毛细管直，则可以将毛细管直接插入质谱仪离子源，因为毛细管载气流量比接插入质谱仪离子源，因为毛细管载气流量比填充柱小很多，不会破坏质谱仪真空。填充柱小很多，不会破坏质谱仪真空。l在在GC/MS分析中，常用的分析中，常用的离子源离子源有电子轰有电子轰击离子源（击离子源（EI），化学电离源（），化学电离源（CI），），EI/CI复合源，场致电离源（复合源，场致电离源（FI），大气），大气压化学电离源（压化学电离源（APCI）等。）等。仪器结构仪器结构色谱色谱- -四极杆质谱仪结构示意图四极杆质谱仪

27、结构示意图LC-MS 液质联用液质联用l大多数高效液相色谱的组分是非挥发性的或热分大多数高效液相色谱的组分是非挥发性的或热分解性的，这使得由液相转化为气相的任务更具有解性的，这使得由液相转化为气相的任务更具有挑战性，尤其是要保证组分的完整性。挑战性，尤其是要保证组分的完整性。l最常用的三种最常用的三种连接方式连接方式是热喷雾是热喷雾(TSP(TSP）法、电喷）法、电喷雾（雾（ESIESI）法和大气压电离（）法和大气压电离（APCIAPCI）法。）法。液质联用流程图液质联用流程图LC-MS分析条件的选择分析条件的选择电离源的选择电离源的选择lESI和和APCI在实际应用中表现出它们各自的优势在实

28、际应用中表现出它们各自的优势和弱点。和弱点。ESI适合于中等极性到强极性的化合物分子，特适合于中等极性到强极性的化合物分子，特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子（蛋白质）。只要有相以获得多个质子的大分子（蛋白质）。只要有相对强的极性，对强的极性，ESI对小分子的分析常常可以得到对小分子的分析常常可以得到满意的结果。满意的结果。APCI不适合多电荷的大分子分析，它的优势在不适合多电荷的大分子分析，它的优势在于非极性或中等极性的小分子的分析。于非极性或中等极性的小分子的分析。电离方式电离方式 ESI采用离子蒸发方式使样品分子电

29、离，而采用离子蒸发方式使样品分子电离，而APCI电离是放电探针促使溶剂和其它反应物电离、碰撞及电荷电离是放电探针促使溶剂和其它反应物电离、碰撞及电荷转移等方式形成了反应气等离子区，样品分子通过等离子转移等方式形成了反应气等离子区，样品分子通过等离子区时，发生了质子转移。区时，发生了质子转移。样品流速样品流速 APCI源允许的流量相对较大，源允许的流量相对较大，0.2-2mL/min，而，而ESI源允许流量相对较小，最大只能为源允许流量相对较小，最大只能为1.0mL/min。断裂程度断裂程度 APCI源的探头处于高温，可使热不稳定的化合源的探头处于高温，可使热不稳定的化合物分解，产生碎片；物分解

30、，产生碎片；ESI源探头处于常温，常生成分子离源探头处于常温，常生成分子离子峰，不易产生碎片。子峰，不易产生碎片。灵敏度灵敏度 都很高。都很高。ESI有利于分析生物大分子及其他分子量有利于分析生物大分子及其他分子量大的化合物，而大的化合物，而APCI更适合于分析极性小的化合物。更适合于分析极性小的化合物。多电荷多电荷 APCI源不能生成一系列多电荷离子，所以不适合源不能生成一系列多电荷离子，所以不适合分析生物大分子。而分析生物大分子。而ESI源特别适合于蛋白质、多肽类的源特别适合于蛋白质、多肽类的生物分子，由于它能产生一系列的多电荷离子。生物分子，由于它能产生一系列的多电荷离子。流动相的选择流动相的选择l常用的溶剂和缓冲液常用