实验五酶联免疫吸附试验(ELISA)补体结合反应

1、实验五实验五 1.1.酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA)ELISA)2.2.补体结合反应补体结合反应1.1.酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA)ELISA)免疫标记技术免疫标记技术定义：定义： 将抗原将抗原- -抗体反应与标记技术相结合，用抗体反应与标记技术相结合，用放射放射性同位素、酶或荧光素性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。分类：分类： 放射免疫测定法：放射免疫测定法：131131I I，3232P P 免疫荧光技术：免疫荧光技术：FITCFITC，P

2、EPE 免疫酶测定法：免疫酶测定法：HRPHRP，APAP免疫酶测定法免疫酶测定法酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。中未知抗体或抗原的方法。将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗检测液相中未知抗体检测液相中未知抗体将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原检测液相中的可溶性抗原将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体检测液

3、相中的可溶性抗原或抗体酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（以间接性（以间接性ELISAELISA为例）为例）：实验内容：实验内容： 间接法测定溶血素间接法测定溶血素 定性检测定性检测实验材料实验材料脱纤维绵羊红细胞脱纤维绵羊红细胞 抗原抗原兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素）兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素） 待测兔血清待测兔血清HRPHRP标记羊抗兔标记羊抗兔IgG IgG 二抗二抗包被缓冲液：包被缓冲液：0.05M pH9.60.05M pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液洗涤液：含洗涤液：含0.05% Tween 200.05% Tween 20的的0.01M pH7.4 PBS0.01M pH7.4 P

4、BS底物缓冲液：底物缓冲液： pH5.0pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液磷酸盐柠檬酸缓冲液底物溶液：底物溶液：OPD 10mgOPD 10mg，底物缓冲液，底物缓冲液25ml25ml，30% H30% H2 2O O2 2 40L 40L酶标板，酶标仪酶标板，酶标仪实验方法实验方法1.1.抗原的处理：抗原的处理：2.2.包被抗原：包被抗原：取出包被好抗原的酶标板（取出包被好抗原的酶标板（4 4孔孔/ /组），甩干孔内液体组），甩干孔内液体以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次3.3.加待测血清加待测血清标记各孔，加入相应液体标记各孔，加入相应

5、液体100L/100L/孔孔1234阴阴性性空空白白阳阳性性待待测测4.4.加二抗：加二抗：3737，湿盒内，湿盒内，30min30min甩干孔内液体甩干孔内液体以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次各孔加入酶标二抗各孔加入酶标二抗100L/100L/孔孔3737，湿盒内，湿盒内，30min30min5.5.显色：显色：甩干孔内液体甩干孔内液体以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次加入底物溶液加入底物溶液100L/100L/孔孔避光显色，避光显色，10min10min6.6.观察结果

6、观察结果实验方法实验方法 阳性：显色为黄色阳性：显色为黄色 阴性：无色阴性：无色1 2 3 4阴性阴性阴性阴性 阳性阳性阳性阳性注意事项注意事项 洗涤彻底，避免交叉污染。洗涤彻底，避免交叉污染。 按顺序加样，孔底无气泡。按顺序加样，孔底无气泡。 包被和温育在湿盒内进行。包被和温育在湿盒内进行。2.2.补体结合反应补体结合反应（Complement fixation Test, CFTComplement fixation Test, CFT）概念：概念： 补体结合反应：补体结合反应： 是指在是指在补体补体的参与下，以绵羊红细胞的参与下，以绵羊红细胞（SRBCSRBC）和溶血素（抗）和溶血素（抗

7、SRBCSRBC的抗体）作为的抗体）作为指指示系统示系统的的抗原抗体反应抗原抗体反应。补反中包括补反中包括两个系统两个系统五种成分：五种成分： 待检系统：已知待检系统：已知AgAg或或AbAb、待检、待检AbAb或或AgAg及及仅供一组仅供一组Ag-AbAg-Ab系统反应的定量补体。系统反应的定量补体。 指示系统：绵羊红细胞和溶血素。指示系统：绵羊红细胞和溶血素。原理：原理：1 21 12 21 12 21：No Ab； 2：AbAg待测血清待测血清 AbAb阳性阳性No AbNo Ab阴性阴性AgAgAg 抗原：伤寒菌裂解产物抗原：伤寒菌裂解产物 待测血清：待测血清：5656，30min30min 补体：豚鼠血清补体：豚鼠血清 2%2%绵羊红细胞绵羊红细胞 溶血素溶血素材料：材料：方法：方法：123450.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL 摇匀，摇匀，3737，水浴，水浴15min15min（1 1份份/2/2人）人）预期结果：预期结果：1 1管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。明呈红色为溶血。溶血溶血不