免疫组化技术 (2)

1、关于免疫组化技术关于免疫组化技术 (2)(2)现在学习的是第一页，共47页组织化学染色技术组织化学染色技术v Histochemistry Techniquev 观察对象 组织、细胞v 使用工具 普通显微镜 荧光显微镜形态与结构现在学习的是第二页，共47页苏木素曙红现在学习的是第三页，共47页免疫组织化学染色技术免疫组织化学染色技术v Immunohistochemistry Technique 指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原（目的蛋白）进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。现在学习的是第四页，共47页Immunohistochemis

2、try Technique特定蛋白（抗原）现在学习的是第五页，共47页（透膜）现在学习的是第六页，共47页授课提纲授课提纲v 基质标本的制作v 荧光免疫组化技术v 酶免疫组化技术v 相关问题与解决方案现在学习的是第七页，共47页授课提纲授课提纲v 基质标本的制作v 荧光免疫组化技术v 酶免疫组化技术v 相关问题与解决方案现在学习的是第八页，共47页标本类型标本类型v 组织标本 冰冻切片 石蜡切片v 细胞标本 体外培养细胞（单层细胞、悬浮细胞） 体液细胞（涂片）现在学习的是第九页，共47页固定与保存固定与保存v 固定的目的 防止细胞自溶，保持细胞形态与机构； 保存组织细胞抗原性； 防止标本脱落；

3、 防止滋生微生物，预防组织腐败v 标本固定以不损伤细胞形态、不损伤抗原特异性为基本原则现在学习的是第十页，共47页固定与保存固定与保存v 固定剂 蛋白类 乙醇或甲醇 微生物类 丙酮、三氯化碳 多糖类 10%福尔马林现在学习的是第十一页，共47页抗原修复抗原修复v 目的： 充分暴露抗原表位，利于抗体识别。v 方法： 酶（无花果蛋白酶，胰蛋白酶）消化法； 盐酸水解 微波处理 煮沸法现在学习的是第十二页，共47页授课提纲授课提纲v 基质标本的制作v 荧光免疫组化技术v 酶免疫组化技术v 相关问题与解决方案现在学习的是第十三页，共47页标记物标记物v 荧光素 异硫氰酸荧光素（FITC） 四乙基罗丹明（

4、RB200） 藻红蛋白（PE） 藻红蛋白花青苷（PE-Cy5）现在学习的是第十四页，共47页技术类型技术类型v 直接染色法 荧光素直接标记在特异性抗体（Ab1)v 间接染色法 荧光素标记第二抗体（Ab2) 第二抗体针对第一抗体种属特异性的表 位（如羊抗鼠Ig或羊抗人Ig）现在学习的是第十五页，共47页直接法直接法现在学习的是第十六页，共47页实例：细胞鉴定实例：细胞鉴定v 免疫细胞及其亚群（流式细胞术） T细胞 CD3+ CD4+ CD8+ B细胞 NK细胞现在学习的是第十七页，共47页免疫细胞分类与计数免疫细胞分类与计数18Suppressor T cellR1T cell / B cell

5、Helper T cell现在学习的是第十八页，共47页间接法间接法现在学习的是第十九页，共47页实例：检测抗核抗体实例：检测抗核抗体v 检测原理 已知抗原 肝细胞/HEp-2 待检抗体 第二抗体 荧光标记兔抗人Ig现在学习的是第二十页，共47页实例：检测病原体（病毒、细菌）实例：检测病原体（病毒、细菌）v检测原理 待检病毒（抗原） 已知抗体单抗或多抗第二抗体荧光标记羊抗鼠（或兔）Ig现在学习的是第二十一页，共47页荧光显微镜（落射式）荧光显微镜（落射式）v关键 汞灯光源 激发滤片 暗场聚光镜 吸收滤片现在学习的是第二十二页，共47页荧光显微镜（落射式）荧光显微镜（落射式）现在学习的是第二十三

6、页，共47页荧光显微镜（落射式）荧光显微镜（落射式）现在学习的是第二十四页，共47页授课提纲授课提纲v 基质标本的制作v 荧光免疫组化技术v 酶免疫组化技术v 相关问题与解决方案现在学习的是第二十五页，共47页主要类型主要类型v 酶标记抗体 同荧光免疫组化v 非酶标记抗体 酶-抗酶系统 生物素-链霉亲和素系统现在学习的是第二十六页，共47页技术特点技术特点v以酶作为抗原，制备抗酶抗体；v酶（抗原）与抗酶（抗体）结合制备酶-抗酶复合物；v通过桥联抗体与识别系统（待检抗原-特异性抗体）连接；现在学习的是第二十七页，共47页酶桥法酶桥法现在学习的是第二十八页，共47页常用酶和相应底物常用酶和相应底物

7、v 过氧化物酶 Peroxidase（P） 二氨基联苯胺（DAB）v 碱性磷酸酶（AP） alkaline phosphatase（AP） 溴氯羟吲哚磷酸盐（BCIP） 现在学习的是第二十九页，共47页过氧化物酶过氧化物酶- -抗过氧化物酶（抗过氧化物酶（PAPPAP）法）法PAPPAP复合物现在学习的是第三十页，共47页抗体选择抗体选择v 第一抗体 识别抗原v 第二抗体（桥联抗体） 能同时与第一、第三抗体结合v 第三抗体 抗酶抗体 与第一抗体同源现在学习的是第三十一页，共47页PPPAAA 图图 双酶双底物双酶双底物(复合物法复合物法)双重酶标染色原理双重酶标染色原理兔兔PAPGAR IgG

8、兔抗兔抗Ag鼠鼠APAAPGAM. IgG鼠抗鼠抗现在学习的是第三十二页，共47页实例：淋巴瘤轻链双重染色法实例：淋巴瘤轻链双重染色法v 一抗一抗 兔抗兔抗 鼠抗鼠抗v 二抗二抗 羊抗兔羊抗兔 羊抗鼠羊抗鼠v 显色系统显色系统 PAPPAP APAAP APAAP现在学习的是第三十三页，共47页亲和素亲和素- -生物素生物素- -过氧化物酶复合体（过氧化物酶复合体（ABCABC）v 生物素（Biotin）v 亲和素（Avidin）v 生物素标记抗体（B-Ab）v 生物素标记过氧化物酶（B-P）现在学习的是第三十四页，共47页亲和素亲和素- -生物素生物素- -过氧化物酶复合体（过氧化物酶复合体

9、（ABCABC）现在学习的是第三十五页，共47页EnVision现在学习的是第三十六页，共47页授课提纲授课提纲v 基质标本的制作v 荧光免疫组化技术v 酶免疫组化技术v 相关问题与解决方案现在学习的是第三十七页，共47页现在学习的是第三十八页，共47页识别抗体（第一）选择识别抗体（第一）选择v 单克隆抗体（McAb） 特异性强 敏感性差v 多克隆抗体（McAb） 特异性差 敏感性强现在学习的是第三十九页，共47页识别（第一）抗体选择识别（第一）抗体选择构象 糖基化碳水化合物现在学习的是第四十页，共47页第二抗体选择第二抗体选择现在学习的是第四十一页，共47页选择显色系统选择显色系统v 荧光免疫组化v 酶免疫组化 PAP APAAP ABC LAB？现在学习的是第四十二页，共47页封闭非特异性结合封闭非特异性结合现在学习的是第四十三页，共47页特异性显色特异性显色v 具备 特定部位显色 特定组织、特定细胞、特定结构 不均一显色 现在学习的是第四十四页，共47页非特异性