第四章微生物生长与生活环境

1、四、 微生物培养与生长规律第一节第一节 微生物纯培养微生物纯培养第二节第二节 微生物纯培养群体生长规律微生物纯培养群体生长规律第一节第一节 微生物纯培养微生物纯培养实验室条件下，由一个微生物细胞繁殖得到的后代。实验室条件下，由一个微生物细胞繁殖得到的后代。纯培养基本步骤：纯培养基本步骤：稀释平皿法稀释平皿法划线法划线法单细胞挑取法单细胞挑取法纯培养方法纯培养方法 (2) 培养培养(1) 分离分离一、微生物纯培养的概念一、微生物纯培养的概念第一节第一节 微生物纯培养微生物纯培养二、微生物纯培养技术二、微生物纯培养技术1、稀释平板分离法、稀释平板分离法：倾注平板法和涂布平板法。：倾注平板法和涂布平

2、板法。 基本过程：（基本过程：（1）梯度稀释过程；（）梯度稀释过程；（2）分离培养过程）分离培养过程涂布涂布倾注倾注梯梯 度度 稀稀 释释 过过 程程10-110-210-310-410-510-62、单细胞挑取法：、单细胞挑取法： 从待分离材料中挑从待分离材料中挑取一个细胞来培养，取一个细胞来培养，从而获得纯培养的过从而获得纯培养的过程。程。第一节第一节 微生物纯培养微生物纯培养二、微生物纯培养技术二、微生物纯培养技术3、平皿划线法、平皿划线法 用接种环沾少许待分离的材料，在培养基表面进行多次平行划线，使微用接种环沾少许待分离的材料，在培养基表面进行多次平行划线，使微生物细胞分开生长以获得微

3、生物纯培养的过程。生物细胞分开生长以获得微生物纯培养的过程。第一节第一节 微生物纯培养微生物纯培养二、微生物纯培养技术二、微生物纯培养技术三、微生物无菌操作与接种技术三、微生物无菌操作与接种技术培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。 （1）培养基与接菌工具的灭菌（2）保证接菌过程的无菌操作灭菌方法灭菌方法一、高温灭菌一、高温灭菌湿热灭菌湿热灭菌干热灭菌：干燥条件，干热灭菌：干燥条件，160维持维持1-2h。高压蒸汽灭菌法：密闭条件下，水加热蒸发形成高

4、压高压蒸汽灭菌法：密闭条件下，水加热蒸发形成高压 的同时产生高温。利用高温杀死菌。的同时产生高温。利用高温杀死菌。巴斯德消毒法：采用巴斯德消毒法：采用60-70的温度处理的温度处理15-30min 的消毒方法。的消毒方法。间歇灭菌法：间歇灭菌法：100，30-60min 冷却，冷却，37培养培养1d反复三次反复三次1、紫外线：、紫外线：杀菌波长范围：杀菌波长范围：240300nm 杀菌力最强范围：杀菌力最强范围： 255265nm 二、辐二、辐 射射紫外线杀菌特点：紫外线杀菌特点： 穿透力差，用作穿透力差，用作表面消毒表面消毒或或空气灭菌空气灭菌，30min灭菌灭菌95%以上以上2、放射性同位

5、素：、放射性同位素：Co60等，主要用于诱变产生新品种等，主要用于诱变产生新品种（一）纯培养的保存（一）纯培养的保存第一节第一节 微生物纯培养微生物纯培养四、纯培养的保存与复壮四、纯培养的保存与复壮保存过程的注意点保存过程的注意点：防止杂菌污染。：防止杂菌污染。1、传代保存法2、液体石蜡覆盖保存法3、载体保存法4、悬液保存法5、寄主保存法6、冷冻保存法（二）纯培养的衰退与复壮（二）纯培养的衰退与复壮第一节第一节 微生物纯培养微生物纯培养四、纯培养的保存与复壮四、纯培养的保存与复壮衰退的原因：衰退的原因：衰老、变异衰老、变异衰退的表现：衰退的表现：生长缓慢生长缓慢优良性状的丧失优良性状的丧失抗逆

6、性下降抗逆性下降衰退的预防：衰退的预防：控制传代频率控制传代频率创造良好的培养条件创造良好的培养条件采取有效的保存方式采取有效的保存方式复壮复壮 选优选优汰劣汰劣一、微生物生长量的测定一、微生物生长量的测定第二节第二节 微生物纯培养群体生长规律微生物纯培养群体生长规律微生物生长量的测定微生物生长量的测定微生物数量的测定微生物数量的测定显微镜直接计数法显微镜直接计数法平板计数法平板计数法比浊法比浊法称重法称重法含含N量测定法量测定法DNA含量测定法含量测定法ATP含量测定法含量测定法代谢活性法代谢活性法微生物重量的测定微生物重量的测定(一一) 微生物数量的测定微生物数量的测定 1、显微镜直接计数

7、法、显微镜直接计数法 使用细菌计数板或血球计数板在显微镜下直接计数。使用细菌计数板或血球计数板在显微镜下直接计数。 优点优点：操作简便，计数直观。：操作简便，计数直观。一、微生物生长量的测定一、微生物生长量的测定第二节第二节 微生物纯培养群体生长规律微生物纯培养群体生长规律2、平板计数法、平板计数法 对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。 优点优点：传统计数方法。对设备要求不高。：传统计数方法。对设备要求不高。一、微生物生长量的测定一、微生物生长量的测定第二节第二节 微生物纯培养群体生长规律微生物纯培养群体生长规律10-310-510-410-6、比浊计数法、

8、比浊计数法根据细菌悬浮液的吸光度测根据细菌悬浮液的吸光度测定其数量。定其数量。优点优点：简便，直接。：简便，直接。一、微生物生长量的测定一、微生物生长量的测定第二节第二节 微生物纯培养群体生长规律微生物纯培养群体生长规律(二二) 微生物重量的测定微生物重量的测定 1、称重法、称重法 用离心或过滤的方法将菌体从培养基中分离、冼净，称湿重或干重。用离心或过滤的方法将菌体从培养基中分离、冼净，称湿重或干重。 优优 点：点：简单可靠。简单可靠。 一、微生物生长量的测定一、微生物生长量的测定第二节第二节 微生物纯培养群体生长规律微生物纯培养群体生长规律在活性污泥法中采用的指标：在活性污泥法中采用的指标：

9、（1）混合液悬浮固体）混合液悬浮固体(MLSS)（粗放测定）（粗放测定） 污泥污泥干燥干燥-称重称重(W1)（2）挥发性悬浮固体）挥发性悬浮固体(MLVSS)（相对准确）（相对准确） 上述已称重污泥上述已称重污泥-马福炉马福炉(500度度2小时小时)-冷却冷却-称重称重(W2)(二二) 微生物重量的测定微生物重量的测定 2、含氮量测定法、含氮量测定法 根据样品中菌体蛋白质含量计算微生物重量的方法。根据样品中菌体蛋白质含量计算微生物重量的方法。 一、微生物生长量的测定一、微生物生长量的测定第二节第二节 微生物纯培养群体生长规律微生物纯培养群体生长规律原理原理：（：（1）微生物蛋白质含量稳定）微生

10、物蛋白质含量稳定 （2）氮是蛋白质的稳定成分）氮是蛋白质的稳定成分 (蛋白质量蛋白质量=6.25总含总含N量量)优点优点：测定准确。：测定准确。“？”第二节第二节 微生物纯培养群体生长规律微生物纯培养群体生长规律（1）分批培养（2）连续培养二、细菌分批培养群体生长规律二、细菌分批培养群体生长规律第二节第二节 微生物纯培养群体生长规律微生物纯培养群体生长规律分批培养分批培养(batch (batch culture)culture)：将少量的菌：将少量的菌体接种到一定体积的液体接种到一定体积的液体培养基中，在适宜的体培养基中，在适宜的条件下培养，最后一次条件下培养，最后一次性收获的过程。性收获的

11、过程。生长曲线生长曲线(growth curve)代表细菌在新的适宜的环境中生长、繁殖、衰老代表细菌在新的适宜的环境中生长、繁殖、衰老、死亡的动态变化。、死亡的动态变化。生长曲线：生长曲线：以培养时间为横坐标，以细菌的数目的对数为纵坐标绘制成的曲线图。 根据细菌生长繁殖速率将生长曲线分四个阶段：根据细菌生长繁殖速率将生长曲线分四个阶段：第二节第二节 微生物纯培养群体生长规律微生物纯培养群体生长规律缓慢期缓慢期 对数期对数期 稳定期稳定期 衰亡期衰亡期二、细菌分批培养群体生长规律二、细菌分批培养群体生长规律第二节第二节 微生物纯培养群体生长规律微生物纯培养群体生长规律缓慢期（缓慢期（延迟期、滞留

12、适应期）滞留适应期滞留适应期二、细菌分批培养群体生长规律二、细菌分批培养群体生长规律特特 点：点：分裂迟缓。分裂迟缓。产生及影响缓慢期长短的因素产生及影响缓慢期长短的因素、培养基成分、培养基成分、菌株的遗传性、菌株的遗传性、接种量、接种量接种时的机械损伤引接种时的机械损伤引第二节第二节 微生物纯培养群体生长规律微生物纯培养群体生长规律对数期对数期（指数生长期）指数生长期）特点：特点： （1）代谢活性强）代谢活性强 （2）世代时短而稳定）世代时短而稳定对数生长期对数生长期二、细菌分批培养群体生长规律二、细菌分批培养群体生长规律 Nt=2n N0 n=3.33(lgNt-lgN0) G=t/n=0

13、.301t/(lgNt-lgN0) n繁殖代数；繁殖代数；G世代时世代时(每繁殖一代所需的时间每繁殖一代所需的时间) N0对数生长期开始微生物数量对数生长期开始微生物数量 Nt对数生长期经过时间对数生长期经过时间t后微生物数量后微生物数量例题：u利用250ml三角瓶培养菌体细胞，实验初利用分光光度计在600nm 测得菌体浓度为OD=0.1,(设每个OD=100个/ml)，培养24小时后测得菌体浓度为OD=100，计算假设菌液体积为100ml不变，求菌体的传代数与世代时约等于多少？第二节第二节 微生物纯培养群体生长规律微生物纯培养群体生长规律稳定期稳定期（最高生长量期）（最高生长量期）最高生长量

14、期最高生长量期特特 点：点：1、细菌数量增加率为、细菌数量增加率为0。2、细菌大量积累代谢产物。、细菌大量积累代谢产物。二、细菌分批培养群体生长规律二、细菌分批培养群体生长规律第二节第二节 微生物纯培养群体生长规律微生物纯培养群体生长规律衰亡期衰亡期特特 点：菌体活性降低、大量死亡；点：菌体活性降低、大量死亡； 细胞畸变、自溶细胞畸变、自溶 革兰氏染色不稳定革兰氏染色不稳定（why?）衰亡期衰亡期二、细菌分批培养群体生长规律二、细菌分批培养群体生长规律什么时期菌体代谢产物最多什么时期菌体代谢产物最多什么时期细菌细胞代谢活性最强什么时期细菌细胞代谢活性最强什么时候细菌细胞总数最多什么时候细菌细胞

15、总数最多什么时期细菌细胞生长速度最快什么时期细菌细胞生长速度最快什么时期世代时间短而稳定什么时期世代时间短而稳定对数生长期对数生长期稳定期稳定期稳定期稳定期对数生长期对数生长期对数生长期对数生长期第二节第二节 微生物纯培养群体生长规律微生物纯培养群体生长规律小小 结结二、细菌分批培养群体生长规律二、细菌分批培养群体生长规律第二节第二节 微生物纯培养群体生长规律微生物纯培养群体生长规律三、连续培养三、连续培养 以一定流速输入新鲜培养液并流出培养物，确保流出的菌数等于新增以一定流速输入新鲜培养液并流出培养物，确保流出的菌数等于新增数，使培养保持对数生长的过程。数，使培养保持对数生长的过程。 优优 点：点： 提高食品工业生产效