基因工程(跨课程)综合性实验

1、基因工程(跨课程)综合性实验生命科学与生物制药学院李黄金前言作为我院的本科生，了解生物技术药物研究、作为我院的本科生，了解生物技术药物研究、开发和生产的过程，掌握与生产工艺和质量控制开发和生产的过程，掌握与生产工艺和质量控制研究密切相关的技术手段是非常必要的。研究密切相关的技术手段是非常必要的。 生命科学与生物制药学院前言以蛋白质为基础的基因工程药物和基因工以蛋白质为基础的基因工程药物和基因工程抗体是当今最主要的生物技术药物形式，程抗体是当今最主要的生物技术药物形式，以以DNADNA为基础的基因治疗制剂和为基础的基因治疗制剂和DNADNA疫苗是疫苗是未来生物制药的主要发展方向之一。未来生物制药

2、的主要发展方向之一。 前言基因工程基因工程、发酵工艺学发酵工艺学和和生物生物技术药物药剂与药动学技术药物药剂与药动学本综合性实验即为上述三门课程的跨课程本综合性实验即为上述三门课程的跨课程综合性实验。综合性实验。 综合实验综合实验I 重组蛋白质类药物重组蛋白质类药物 重组类药物重组类药物5、表达进程与影响因素分析4、工程菌生长曲线分析2、工程菌表达筛选6、工程菌发酵7、表达产物分离纯化3、工程菌甘油种制备1、工程菌构建1、TCR工程菌构建3、TCR质粒-脂质体复合物制备4、TCR体外基因转染2、TCR质粒DNA大规模制备5、TCR转染基因表达检测6、TCR转染体外活性检测7、TCR转染体内试验

3、（药代、药效）综合实验项目班级班级日程日程04（1）班）班（先做重组蛋白质药物单元）（先做重组蛋白质药物单元）04（2）班）班（先做重组（先做重组DNA药物单元）药物单元）第1天4日/6月星期一Am：综合实验公开课（课室：B2-314，8:30准时开始）Pm：单元讨论、IL-18工程菌构建、IL-18菌种活化接种和平板划线接种Pm：单元讨论、TCR工程菌构建、TCR菌种活化接种第2天5日/6月星期二工程菌表达筛选（温控表达诱导）工程菌生长曲线分析 质粒DNA大规模制备：碱法裂解、中和、异丙醇沉淀、洗盐第3天6日/6月星期三工程菌表达筛选SDSPAGE（凝胶保存备用），选定菌株，接种 质粒DNA

4、大规模制备：层析纯化、电泳鉴定、紫外吸收法测定质粒纯品纯度和浓度第4天7日/6月星期四工程菌甘油种制备表达影响因素试验表达进程试验接种质粒-脂质体复合物制备、包封率测定、T细胞体外基因转染第5天8日/6月星期五表达影响因素试验SDS-PAGE表达进程试验转染T细胞体外活性检测之一：肿瘤细胞接种，培养第6天9日/6月星期六星期六准备准备转染T细胞目的基因表达检测：T细胞-肿瘤细胞共培养、流式样品制备和检测第7天10/6月星期日星期日准备准备转染T细胞体外活性检测之二：流式细胞仪分析细胞凋亡实实验验日日程程第8天11日/6月星期一表达进程分析SDS-PAGE（胶保存备用）转染T细胞体内给药实验试验

5、结果讨论与分析、看病理与免疫组化照片第9天12日/6月星期二SDS-PAGE凝胶扫描分析（三次电泳胶）发酵罐观摩（418室）准备准备第10天13日/6月星期三表达产物产物的分离纯化（示教）试验结果分析与讨论重组重组DNA药物单元开始，药物单元开始，TCR菌种接种菌种接种下午：下午：重组蛋白药物单元开始，重组蛋白药物单元开始，IL-18接接试管与平板划线接种试管与平板划线接种第11天14日/6月星期四质粒DNA大规模制备：碱法裂解、中和、异丙醇沉淀、洗盐工程菌表达筛选（温控表达诱导）工程菌生长曲线分析第12天15日/6月星期五 质粒DNA大规模制备：离子交换层析纯化、电泳鉴定、紫外吸收法测定质粒

6、纯品纯度和浓度工程菌表达筛选SDSPAGE（凝胶保存备用），选定菌株。班级班级日程日程04（1）班）班（先做重组蛋白质药物单元）（先做重组蛋白质药物单元）04（2）班）班（先做重组（先做重组DNA药物单元）药物单元）实实验验日日程程第13天16日/6月星期六星期六准备准备准备准备第14天17日/6月星期日星期日下午接种（每组派下午接种（每组派1个代表）个代表）下午接种（每组派下午接种（每组派1个代表）个代表）第15天18日/6月星期一质粒-脂质体复合物制备、包封率测定、T细胞体外基因转染工程菌甘油种制备表达影响因素试验表达进程试验接种（GST菌种）第16天19日/6月星期二转染T细胞体外活性检

7、测：肿瘤细胞接种，培养表达影响因素试验SDS-PAGE（胶保存备用）表达进程试验（IPTG诱导、不同时间点取样）第17天20日/6月星期三转染T细胞体外活性检测：T细胞与肿瘤细胞共培养表达进程分析SDS-PAGE（胶保存备用）第18天21日/6月星期四转染T细胞体外活性检测与目的基因表达检测：流式细胞仪分析SDS-PAGE凝胶扫描分析（三次电泳胶）发酵罐观摩（418室）第19天22日/6月星期五转染T细胞体内给药实验试验结果讨论与分析表达产物产物的分离纯化（示教）试验结果分析与讨论班级班级日程日程04（1）班）班（先做重组蛋白质药物单元）（先做重组蛋白质药物单元）04（2）班）班（先做重组（先

8、做重组DNA药物单元）药物单元）实实验验日日程程实验分组 每个班按学号顺序分为每个班按学号顺序分为8 8组，组号按序依次为组，组号按序依次为1 18 8组。组。 每组人数分别为每组人数分别为9 9、9 9、9 9、8 8、8 8、8 8、8 8、8 8。 涉及到排序的实验项目，如在超净工作台上的接种步涉及到排序的实验项目，如在超净工作台上的接种步骤，一律按骤，一律按1 1到到8 8组顺序进行。组顺序进行。实验编号 实验过程中必需对试管、摇瓶等进行标记，故统一进实验过程中必需对试管、摇瓶等进行标记，故统一进行编号。行编号。 编号规则为：班代表字母编号规则为：班代表字母+ +组号组号- -成员号，

9、成员号，A A代表代表1 1班，班，B B代表代表2 2班。班。 举例：举例：0404（1 1）班）班8 8组组8 8号同学挑取的转化子标记为号同学挑取的转化子标记为A8-8A8-8实验要求与质量控制 1 1、预习、预习实验前须充分预习，要求随机抽查时，每一位同学能实验前须充分预习，要求随机抽查时，每一位同学能够清晰的阐述整体实验思路和具体的实验项目、原理。够清晰的阐述整体实验思路和具体的实验项目、原理。 实验要求与质量控制 、实验过程、实验过程（）实验纪律（）实验纪律（）（）主动性、能动性与团队精神相接合主动性、能动性与团队精神相接合（）（）合理安排时间合理安排时间 ，将能否在规定时间内完成

10、实验，将能否在规定时间内完成实验内容作为衡量学生动手能力的关键指标之一内容作为衡量学生动手能力的关键指标之一 实验要求与质量控制 、实验原始记录与结果整理、实验原始记录与结果整理每天必须及时、真实、完整地记录当天所做实验情每天必须及时、真实、完整地记录当天所做实验情况。况。记录实验过程中的异常情况，记录实验过程中的异常情况，分析其原因分析其原因，并将关，并将关键性实验结果整理于实验记录本。键性实验结果整理于实验记录本。记录完成后，找带教老师签名方可离开实验室。记录完成后，找带教老师签名方可离开实验室。若记录情况不好，带教老师不能签名。若记录情况不好，带教老师不能签名。 实验要求与质量控制 、实

11、验原始记录与结果整理、实验原始记录与结果整理（）重组蛋白药物实验单元关键性结果（）重组蛋白药物实验单元关键性结果1）表达筛选与甘油种制备：随机挑选转化子表达诱导）表达筛选与甘油种制备：随机挑选转化子表达诱导SDS-PAGE凝胶凝胶扫描照片、筛选确定的工程菌株株号及其表达水平（扫描照片、筛选确定的工程菌株株号及其表达水平（%）。）。2）生长曲线分析：选定工程菌培养过程中的）生长曲线分析：选定工程菌培养过程中的OD600测定结果表及生长曲测定结果表及生长曲线图。线图。3）表达影响因素试验：不同诱导时机表达诱导实验诱导前、后样品的）表达影响因素试验：不同诱导时机表达诱导实验诱导前、后样品的SDS-P

12、AGE凝胶扫描照片、表达水平（）、凝胶扫描照片、表达水平（）、OD600值。值。4）表达进程试验：工程菌（）表达进程试验：工程菌（GST）表达诱导过程不同时间点样品）表达诱导过程不同时间点样品SDS-PAGE凝胶扫描照片、表达水平（）。凝胶扫描照片、表达水平（）。5）表达产物分离纯化：示教分析与讨论）表达产物分离纯化：示教分析与讨论实验要求与质量控制 、实验原始记录与结果整理、实验原始记录与结果整理（）重组药物实验单元关键性结果（）重组药物实验单元关键性结果1）质粒）质粒DNA大规模制备：阴离子交换纯化层析图、提取和纯化过程中大规模制备：阴离子交换纯化层析图、提取和纯化过程中样品琼脂糖电泳图、

13、质粒纯品纯度和浓度测定结果。样品琼脂糖电泳图、质粒纯品纯度和浓度测定结果。2）质粒）质粒-脂质体复合物制备：包封率测定结果脂质体复合物制备：包封率测定结果 。3）基因转染、体外表达、体外活性、体内给药：示教分析与讨论。）基因转染、体外表达、体外活性、体内给药：示教分析与讨论。综合实验报告须按须按基因工程（跨课程）综合实验论文撰写规范基因工程（跨课程）综合实验论文撰写规范撰写、并提交综合实验报告（电子打印版及电子版）。撰写、并提交综合实验报告（电子打印版及电子版）。 综合实验报告1 1）封面：）封面：标题：标题： 基因工程（跨课程）综合性实验论文基因工程（跨课程）综合性实验论文姓名：姓名： 班级：班级： 学号：学号： 指导教师：李黄金、周林、胡海梅、赵林、陈伟、段涛、指导教师：李黄金、周林、胡海梅、赵林、陈伟、段涛、张玲、袁茵、薄华本、王金全、吴凤麟张玲、袁茵、薄华本、王金全、吴凤麟广东药学院广东药学院生命科学与生物制药学院生命科学与生物制药学院 生物制药研究所生物制药研究所综合实验报告2) 2)知识产权申明知识产权申明本综合性实验所采用的工程菌株与工艺技术参数主要本综合性实验所采用的工程菌株与工艺技术参数主要来源于广东药