放射性自显影技术

1、第四章第四章 放射性自显影技术放射性自显影技术第一节第一节 原理和一般制作程序原理和一般制作程序第二节第二节 放射自显影的制作方法放射自显影的制作方法第三节第三节 与自显影质量有关的几个因素与自显影质量有关的几个因素第四节第四节 放射性自显影技术的应用放射性自显影技术的应用第一节第一节 原理和一般制作程序原理和一般制作程序 一、放射性自显影的原理和特点一、放射性自显影的原理和特点 放射性自显影放射性自显影 利用照相乳胶记录、检查和测量样利用照相乳胶记录、检查和测量样品中放射性核素的分布、定位和定量的品中放射性核素的分布、定位和定量的方法。方法。 放射性自显影的特点放射性自显影的特点（1 1）准

2、确定位；）准确定位；（2 2）灵敏度高；）灵敏度高；（3 3）能保持机体的完整结构；）能保持机体的完整结构；（4 4）可以长期保存；）可以长期保存；（5 5）操作简便，不需要复杂的仪器和设备）操作简便，不需要复杂的仪器和设备。 局限性：局限性： 定量误差大，只作相对定量；测定的速度较慢。定量误差大，只作相对定量；测定的速度较慢。（一）自显影标本的制备（一）自显影标本的制备（二）曝光（二）曝光（三）显影（三）显影（四）定影（四）定影（五）水洗及干燥（五）水洗及干燥二、放射性自显影的一般制作程序二、放射性自显影的一般制作程序1. 1. 洗净；洗净；2. 2. 吸水纸吸干；吸水纸吸干；3. 3. 平

3、铺于标本夹；平铺于标本夹；4. 4. 干燥。干燥。（一）自显影标本的制备（一）自显影标本的制备 曝光曝光 : : 把照相乳胶曝露于射线而产生潜影。把照相乳胶曝露于射线而产生潜影。 1. 1.感光材料的选择感光材料的选择: : 由溴化银和明胶组成。由溴化银和明胶组成。 明胶是溴化银的支持剂，又是溴原子的吸收剂；明胶是溴化银的支持剂，又是溴原子的吸收剂；它决定着乳胶的通透性、吸水膨胀、浓度稀释它决定着乳胶的通透性、吸水膨胀、浓度稀释和坚膜作用等特性。和坚膜作用等特性。 而乳胶的敏感度决定于溴化银的浓度、颗粒大而乳胶的敏感度决定于溴化银的浓度、颗粒大小及其配制方法。小及其配制方法。（二）曝光（二）曝

4、光 乳胶名称乳胶名称卤化银卤化银晶体直晶体直径（径（m）卤化卤化 银银 (%)晶体晶体粒子数粒子数/1000 m3灵灵敏敏度度分分辨辨力力产品特点产品特点适用范围适用范围幻灯片幻灯片电影胶片电影胶片 11015 6差差 中中乳胶层约乳胶层约15m涂于片涂于片基的一面基的一面宏观或光宏观或光学显微自学显微自显影显影X射线乳射线乳胶片胶片 0.2310206高高 差差乳胶层约乳胶层约30m涂于片涂于片基的两面基的两面宏观自显宏观自显影影核乳胶核乳胶0.020.54510000高高 高高液体、液体、干板、干板、脱基膜脱基膜光学显微光学显微及电镜自及电镜自显影显影几种自显影感光材料的性能几种自显影感光

5、材料的性能 （1 1）在有效期内使用。）在有效期内使用。 （2 2）周围不能有放射性物质。）周围不能有放射性物质。 （3 3）X X射线乳胶片和幻灯片应注意避光、防潮、射线乳胶片和幻灯片应注意避光、防潮、防热，最好在恒温恒湿房间（防热，最好在恒温恒湿房间（15201520C C）保存；）保存； （4 4）液体核乳胶应置于棕色玻璃瓶中，外用黑纸）液体核乳胶应置于棕色玻璃瓶中，外用黑纸包好，再用塑料袋包好，保存于包好，再用塑料袋包好，保存于4 4C C冰箱内冰箱内。感光材料的保存：感光材料的保存： 2. 2. 曝光曝光（1 1）潜影的形成）潜影的形成 将溴化银的晶体点陈制作成有缺陷的，这些将溴化银

6、的晶体点陈制作成有缺陷的，这些缺陷构成潜影过程中的缺陷构成潜影过程中的敏化中心敏化中心。 当核射线、光线、热、压力等作用于溴化银当核射线、光线、热、压力等作用于溴化银时，溴化银中的电子便向敏化中心移动，形时，溴化银中的电子便向敏化中心移动，形成带负电荷的静电层，然后正电荷的银离子成带负电荷的静电层，然后正电荷的银离子便向静电层聚集而变成银原子，便向静电层聚集而变成银原子，形成潜影形成潜影。-+1234潜潜 影影 的的 形形 成成 （2 2） 曝光时间曝光时间 a) a) 以公式计算曝光时间：以公式计算曝光时间： 设设L L为单位面积上衰变了的放射性活度；为单位面积上衰变了的放射性活度； A A

7、0 0为单位面积上开始时的放射性活度；为单位面积上开始时的放射性活度； A At t为单位面积上曝光结束时的放射性活度。为单位面积上曝光结束时的放射性活度。 由由 L = AL = A0 0 A At t； A At t= A= A0 0 e e-t-t 得：得： t = Lnt = LnT0.693A0A0- L b b）经验估计）经验估计 要使要使X X乳胶产生适宜的黑度，大约需要乳胶产生适宜的黑度，大约需要50050010001000万万粒子或粒子或100100200200万万粒子粒子/cm2/cm2。 对于对于粒子来说：粒子来说： N/AN/A t t c c）实验曝光法）实验曝光法曝

8、光时间曝光时间 = （0.5 1）107 粒子粒子/cm2 显影显影 指感光后形成潜影的乳胶，在显影剂指感光后形成潜影的乳胶，在显影剂的作用下，使潜影转化为金属银的过程。的作用下，使潜影转化为金属银的过程。 （1 1）显影液的组成：）显影液的组成： 显影剂：常用米吐尔，主要起还原作用。显影剂：常用米吐尔，主要起还原作用。 促进剂：常用碳酸钠，维持碱性条件。促进剂：常用碳酸钠，维持碱性条件。 保护剂：常用亚硫酸钠，中和氧化产物。保护剂：常用亚硫酸钠，中和氧化产物。 抑制剂：常用溴化钾，抑制未感光的银盐。抑制剂：常用溴化钾，抑制未感光的银盐。 （三）显（三）显 影影（2 2）显影条件）显影条件 配

9、制好的显影液应盛于带盖的深色玻配制好的显影液应盛于带盖的深色玻璃瓶中，置于阴凉处或冰箱中。璃瓶中，置于阴凉处或冰箱中。 在温度为在温度为18182020C C 的条件下，显影时的条件下，显影时间约为间约为5 5 6 6 分钟。分钟。 定影定影 定影剂硫代硫酸钠和溴化银作用，将定影剂硫代硫酸钠和溴化银作用，将溴化银溶解，从而使未感光的银盐从乳胶中溶溴化银溶解，从而使未感光的银盐从乳胶中溶去而成为透明膜。去而成为透明膜。 其反应式如下：其反应式如下： AgBr + NaAgBr + Na2 2S S2 2O O3 3 NaAgS NaAgS2 2O O3 3 + NaBr + NaBr NaAgS

10、 NaAgS2 2O O3 3 Na Na+ + + AgS + AgS2 2O O3 3 - - NaAgSNaAgS2 2O O3 3 + + NaNa2 2S S2 2O O3 3 NaNa3 3Ag(SAg(S2 2O O3 3) )2 2 （四）定影（四）定影 （1 1）定影剂：硫代硫酸钠，遇酸易分解。）定影剂：硫代硫酸钠，遇酸易分解。 （2 2）保护剂：常用亚硫酸钠，抑制定影剂的）保护剂：常用亚硫酸钠，抑制定影剂的遇酸分解。遇酸分解。 （3 3）停显剂：常用醋酸、硼酸，中止显影。）停显剂：常用醋酸、硼酸，中止显影。 （4 4）坚膜剂：常用明钒、铬钒。）坚膜剂：常用明钒、铬钒。2.

11、2. 定影液的组成定影液的组成 3. 3. 定影条件定影条件 温度以温度以1920 1920 C C为宜，定影时间约为为宜，定影时间约为10 1510 15分分钟。钟。 （五）水洗及干燥（五）水洗及干燥 定影后要经充分水洗，以清除残余的定影剂和未定影后要经充分水洗，以清除残余的定影剂和未被显影的银盐。被显影的银盐。 一般要求在流水中冲洗一般要求在流水中冲洗20302030分钟，然后在空气分钟，然后在空气中晾干。中晾干。 一、宏观放射性自显影的制作方法一、宏观放射性自显影的制作方法 （一）整体植株的放射性自显影（一）整体植株的放射性自显影 （二）放射性纸层析和薄层层析板自显影（二）放射性纸层析和

12、薄层层析板自显影 （三）土壤整段标本的放射性自显影（三）土壤整段标本的放射性自显影（四）观察（四）观察 二、光学显微自显影二、光学显微自显影 ( (一一) )方法方法 1. 1. 接触法接触法 将试验样品制成石蜡切片，用蛋白甘油将试验样品制成石蜡切片，用蛋白甘油将石蜡切片贴在载片上，可先染或曝光后将石蜡切片贴在载片上，可先染或曝光后染色，干燥后在暗室中将乳胶面对切片，染色，干燥后在暗室中将乳胶面对切片，紧密接触，紧密接触，进行曝光进行曝光。 2 . 2 . 液体乳胶法液体乳胶法 在暗室安全灯下，将所需的乳胶称在暗室安全灯下，将所需的乳胶称出，使其装入烧杯中，置于出，使其装入烧杯中，置于4040

13、C C水浴溶水浴溶解。然后采用滴涂或浸蘸法将乳胶直接解。然后采用滴涂或浸蘸法将乳胶直接加在载玻片上，并使均匀地铺开。凉干加在载玻片上，并使均匀地铺开。凉干后连同标本一起进行曝光。后连同标本一起进行曝光。 具体又可分为：具体又可分为：涂布法和浸蘸法涂布法和浸蘸法。涂布法和浸蘸法示意图涂布法和浸蘸法示意图 （二）染色（二）染色 1. 1. 前染前染 是指涂核乳胶前对切片进行染色。是指涂核乳胶前对切片进行染色。 优点：乳胶层不被染色，与后染相比颜色优点：乳胶层不被染色，与后染相比颜色清晰鲜明。缺点：染色处理可能引起标本中清晰鲜明。缺点：染色处理可能引起标本中放射性的损失；对易溶性放射性化合物不宜放射

14、性的损失；对易溶性放射性化合物不宜采用前染。采用前染。 2. 2. 后染后染 是指在切片涂布核乳胶、曝光、显影、是指在切片涂布核乳胶、曝光、显影、定影后进行的染色。定影后进行的染色。 优点：没有前染的放射性损失问题；优点：没有前染的放射性损失问题； 缺点：在染色过程中可能会使显影银粒缺点：在染色过程中可能会使显影银粒消失，乳胶脱落。消失，乳胶脱落。 1. 1. 粒子计数法粒子计数法 在一定面积上或一定细胞器上的显影银颗在一定面积上或一定细胞器上的显影银颗粒的多少确定样品中的放射性高低。粒的多少确定样品中的放射性高低。 2. 2. 径迹计数径迹计数 根据较厚乳胶层中产生的径迹数，来测根据较厚乳胶

15、层中产生的径迹数，来测定放射性。定放射性。 3. 3. 光密度测定光密度测定：用显微光度计：用显微光度计（ 三）光学显微自显影的观察与分析三）光学显微自显影的观察与分析第三节第三节 与自显影质量有关的与自显影质量有关的几个因素几个因素一、各种粒子在乳胶中的径迹一、各种粒子在乳胶中的径迹 粒子：粒子： 径迹直，密度均匀，图像最好。径迹直，密度均匀，图像最好。 粒子：粒子： 径迹弯弯曲曲，射程因能量而异。径迹弯弯曲曲，射程因能量而异。 粒子：粒子： 一般在乳胶中不留什么痕迹一般在乳胶中不留什么痕迹。 分辨力分辨力 用银粒密度最大的点与其密度减用银粒密度最大的点与其密度减少到一半的点之间的距离（少到

16、一半的点之间的距离（HDHD）来表示。）来表示。 影响分辨力的因素：影响分辨力的因素： （1 1）溴化银颗粒的大小）溴化银颗粒的大小 （2 2）乳胶厚度）乳胶厚度 （3 3）标本厚度）标本厚度 ( 4 ) ( 4 ) 标本与乳胶层的距离标本与乳胶层的距离 （5 5）射线的能量）射线的能量 ： 3 3H H、1414C C、 3232P P （6 6） 曝光和显影时间曝光和显影时间二、分辨力二、分辨力 自显影效率自显影效率 指一个入射粒子所生成显影指一个入射粒子所生成显影颗粒数目。颗粒数目。 其受下列因素影响：其受下列因素影响： （1 1）射线能量）射线能量 （2 2）标本的厚度）标本的厚度 （

17、3 3）乳胶层的厚度：小于射程时）乳胶层的厚度：小于射程时 （4 4）溴化银结晶的大小：小而密时）溴化银结晶的大小：小而密时 （5 5）乳胶的灵敏度）乳胶的灵敏度 （6 6）乳胶层与标本的距离）乳胶层与标本的距离 （7 7）曝光时间）曝光时间三、自显影效率三、自显影效率 在制备自显影的过程中，由于非标在制备自显影的过程中，由于非标本放射源而引起乳胶显影的均称本放射源而引起乳胶显影的均称本底本底。 造成自显影本底的原因有：造成自显影本底的原因有： （1 1）曝光：红灯过亮）曝光：红灯过亮 （2 2）过度显影）过度显影 （3 3）化学假象）化学假象 （4 4）压力和张力）压力和张力 （5 5）环境

18、辐射和天然本底）环境辐射和天然本底四、自显影的本底四、自显影的本底第四节第四节 放射自显影技术的应用放射自显影技术的应用一、遗传育种研究一、遗传育种研究二、土壤中养分移动研究二、土壤中养分移动研究 三、植物营养运转研究三、植物营养运转研究 四、植物保护研究四、植物保护研究 五、五、 农药残留及环境保护研究农药残留及环境保护研究 显微放射性自显影与核酸分子杂交及细胞显微放射性自显影与核酸分子杂交及细胞学技术相结合，发展了原位分子杂交技术。即学技术相结合，发展了原位分子杂交技术。即将完整的细胞核染色体，做成细胞学片子，使将完整的细胞核染色体，做成细胞学片子，使其中的其中的DNADNA固定在载玻片上

19、，并保持它们原固定在载玻片上，并保持它们原来的细胞学位置，进行解链处理后，与用同位来的细胞学位置，进行解链处理后，与用同位素标记的和它互补的素标记的和它互补的RNARNA或单链的或单链的DNADNA溶液溶液杂交，然后进行自显影，可以从中观察到杂交杂交，然后进行自显影，可以从中观察到杂交分子在染色上所占的位置。分子在染色上所占的位置。 为了研究不同营养元素在植物中的循环为了研究不同营养元素在植物中的循环形式，形式， BiddulphBiddulph等向红菜豆水培液中施入等向红菜豆水培液中施入3232P P、3535S S和和4545CaCa，吸收，吸收1 1小时后转入非标记的小时后转入非标记的营

20、养液中。然后按一定时间间隔进行自显影。营养液中。然后按一定时间间隔进行自显影。证明在整个证明在整个9696小时的实验期间，有一部分小时的实验期间，有一部分磷仍在继续运转，硫在开始时是活动的，但磷仍在继续运转，硫在开始时是活动的，但当它进入幼叶后，活动性就停止了。钙却不当它进入幼叶后，活动性就停止了。钙却不同，当它被蒸腾流带入叶子后，就保持在叶同，当它被蒸腾流带入叶子后，就保持在叶中，全不流动。中，全不流动。 从植物对寄生物的影响来看，植物中的从植物对寄生物的影响来看，植物中的放射性物质可以进入寄居其上的病菌或害虫。放射性物质可以进入寄居其上的病菌或害虫。但病菌通过什么组织？在什么时候开始吸收但病菌通过什么组织？在什么时候开始吸收寄主中的养料？寄主中的养料？ 用用3 3H-H-标记的碱基和标记的碱基和1414C-C-乳清酸标记寄主后，乳清酸标记寄主后，用非标记的锈病夏孢子接种，证明在吸器形用非标记的锈病夏孢子接种，证明在吸器形成后才开始吸收，这时寄主中的标记物，通成后才开始吸收，这时寄主中的标记物，通过吸器鞘进入吸器和菌丝体。过吸器鞘进入吸器和菌丝体。 浙江农科院和上海原子核研究所对除草浙江农科院和上海原子核研究所对除草丹的研究证明，稗草吸收丹的研究证明，稗草吸收1414C-C-除草丹的能力除草丹的能力比水稻高比水稻高1