药物研究中的分析法及策略

1、药物研究中的分析法及策略 需强调的是，质谱也有局限性，杂质结构最可靠的确证还是依靠杂质单体的获得和结合其他技术的综合解析。手性杂质手性药物中的对映异构体限量检查越来越受关注，旋光光谱(ORD)、圆二色光谱(CD)的测定仍是目前首选的快速检测方法;手性色谱法不仅可以定性而且是更可靠的定量手段20。HPLC在手性分离方面仍然占据主要地位，运用相对较广泛的手性固定相多数是多糖类，键合相多糖类手性柱也日趋成熟，如ChiralIC柱。其他如环糊精、手性冠醚类、Pirkle型、蛋白质、配体、离子交换以及大环抗生素等手性固定相以及新型柱前衍生化法方面仍有一些新的发展，采用整体柱技术制备手性色谱柱近年来也成为

2、热点。由于UHPLC的出现，小粒径的手性填料也必将成为今后的研究热点。离子液体在手性药物色谱分析上的研究也日渐增多。传统的气相色谱依托着环糊精衍生物等固定相在手性分离中仍然有一定的运用，而利用离子液体进行手性分离成为手性气相色谱的发展方向之一。其他色谱技术，如超临界流体色谱、模拟移动床色谱、高速逆流色谱等在手性药物分析和对映体制备中继续发挥着积极作用。CE具有独特的分离机制，用于药物光学异构体的分析仍是一个较好的选择。毛细管区带电泳(CZE)和胶束电动毛细管电泳(MEKC)仍是应用最多的模式。在CE研究中非水毛细管电泳、毛细管微乳电动色谱、2D-CE、3D-CE等也已成为热点。另外，对毛细管柱

3、的手性改性也是一些研究者关注的对象。由于毛细管电泳在手性分离上的优势，新的手性添加剂仍是其重要的研究方向。而毛细管整体柱的快速发展，使得毛细管电色谱(CEC)技术在手性药物分析上成为新的增长点21。基因毒性杂质的分析4171-191基因毒性杂质(GTIs)的毒性阈值水平也是目前关注的热点。2006年欧洲药品局(EMEA)首先颁布了EvaluationofMedicinesforHumanUse，GuidelineontheLimitsofGenotoxicImpurities，FDA于2008年也正式签发了类似指南22。要识别这些杂质，应该对涉及合成过程的化学反应、与原材料有关的杂质等进行科学

4、地评价。上述指南同时适用于辅料和药物活性物质。基因毒性杂质的控制在药物研究的初期就应考虑，并贯穿于整个药物研发、生产以及上市过程。基因毒性杂质的检测属于痕量分析，对灵敏度、选择性、重现性和耐用性有更高的要求，最常用的分析方法也是LC和GC，及其与质谱的联用。超临界流体色谱法(SFC)和CZE方法最近在GTIs检测中也有一些报道。对于无紫外可见吸收的GTIs，可以选择电雾检测器(CAD)、蒸发光散射检测器(ELSD)等检测器。如果检测器对于GTIs没有特别的专属性，色谱分离就显得尤其重要。若采用GC，常用的检测器是FID和MS，也可以根据GTIs的结构特征来选择理想的检测器(例如ECD)。处方前

5、和早期阶段的分析方法处方前研究应根据不同检测项目的需要选择适当的分析方法。对于药物的鉴别，赋形剂和包装的鉴定，FTIR，NIR和拉曼等光谱技术依然是重要的手段，一些分析技术如衰减全反射红外光谱法(ATR-FTIR)也开始广泛应用到药物研究中。电感耦合等离子体光谱(ICP)，原子光谱和X射线荧光对外来金属污染物的检测已成为必不可少的技术。对于一些新型给药系统，目前药物分析研究的热点集中在高通量的样品前处理技术、自动化技术的研究上。上述研究除了对应的相关技术外，色谱方法仍是最重要和应用最广泛的定性定量手段。HPLC方法液相色谱的发展以色谱填料的发展为基础，新的不同机制的固定相的不断涌现带动了整个液

6、相色谱的发展。由于所研究的化合物实体类型越来越多，对分离的要求也更高，新的功能化和吸附模式的固定相不断涌现，例如用于极性化合物分离的亲水作用色谱(hydro-philicinteractionliquidchromatography，HILIC)，多功能有机杂化硅胶、聚合物固定相、核壳型填料和纳米及亚微米填料等。UHPLC方法亚微米颗粒(2m)填充的微径和纳米级口径的色谱柱，具有高柱效、高分辨率、高峰容量和高流量等优点，促进了UHPLC在药物定性和定量分析中的广泛应用。特别是针对杂质研究，结合扫描速度更快、分辨率更高的质谱检测更具优势。随着更小颗粒填料的使用，能够在更宽的线速度范围内保持恒定柱

7、效，将大幅度改善液相色谱的分离度与灵敏度，微高效液相(micro-HPLC)23和纳米高效液相色谱(nano-HPLC)24将成为未来几年药物色谱分析发展的新热点。整体柱技术在药物色谱分析领域，整体柱已成为药物色谱分析研究的热点25。近年来它在高效、快速、高通量分离分析方面得到了较快的发展，并开始广泛用于药物小分子和生物大分子的分析。整体柱具有通透性优良、制备简单和背压极低等特点，其在快速分离分析和二维液相色谱中具有明显优势，而通过制备超长柱不仅可弥补整体柱载样量的不足，同时也可有效提高其分离能力。目前整体柱的研究主要集中在有机聚合物整体柱，无机-有机杂化整体柱，-环糊精硅胶杂化的手性整体柱的

8、研究。基因工程药物质量研究蛋白类药物结构复杂，加上生产过程所造成的微观不均一性的存在，使得这种复杂性倍增，而且在编译DNA过程中，可能产生非预期的蛋白序列。除了生物大分子的常规分析外，药物分析技术的发展主要体现在以下几个研究领域。肽图分析肽图分析的主要手段是利用蛋白酶对特定的位点进行分解，再采用HPLC-UV或LC-MS等方法进行分离和测定，对蛋白质和多肽结构研究和特性鉴别具有重要意义。传统的方法存在酶解时间长、酶的自身分解以及测定重复性较差等问题。一些研究者利用激光照射提高酶解速度26。在溶液中加入钙离子、减少甲基化和固定化酶等可以解决酶的稳定性问题。其中，由于固定化酶的再使用性、减少底物稀

9、释以及可连续使用等优势已经越来越被广泛的运用到肽图分析中，并且与LC-MS联用后，可以实现对基因工程药物高通量的肽图分析27。另外，由于CE具有样品和试剂消耗低，分离效率高，分析速度快，分离模式多样等优势，加上近年来其检测技术的改善和与质谱联用技术的日趋成熟，使得其在肽图的分析中发挥着越来越大的作用28。氨基酸分析目前氨基酸分析研究主要致力于缩短分析时间，随着同位素标记的发展2930和微波技术的成熟，氨基酸的分析速度变得越来越快。毛细管电泳与质谱联用技术快速高效，已经常被用于氨基酸分析，通过同位素标记，其检测的灵敏度大幅提高。而一些在线的前处理技术与色谱技术的联用为高通量的实现提供了帮助。相对

10、分子质量测定基因工程药物相对分子质量测定的传统方法主要是凝胶电泳或者高分辨质谱，利用沉降速度的差异也可以测定大分子物质的相对分子质量31。同时，纳米技术的发展也带动了相对分子质量测定技术的发展，研究表明加入碳纳米管可以使得聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的效果大大提高32。生物大分子结构的研究生物大分子的生物活性取决于它们复杂的空间构象，常规研究方法有圆二色谱、红外光谱、拉曼光谱、X射线衍射和低温电子显微镜等。利用多维NMR进行蛋白质的结构和分子相互作用研究，以及利用生物质谱进行其结构和定量研究仍是目前研究的热点。体内药物分析及药物代谢体内药物分析逐步从以静态物质为中心向以动态生命科学为基础的方向转变，

11、研究药物的吸收、代谢、分布、排泄、立体选择性、药物的相互作用、药物对内源性代谢的影响，为新药发现提供了新的途径。利用核磁共振、色谱质谱联用等技术，结合化学计量学方法(模式识别、多元校正、多元曲线分辨)，采用组学和系统生物学方法，研究生物体整体或组织细胞系统的动态代谢变化，特别是药物对内源代谢、遗传变异乃至各种物质进入代谢系统的特征和影响，发现相关生物标志物，也是体内药物分析近年来发展的重要方向。体内药物分析中的联用技术联用技术是分析体内药物和代谢物最常用的技术，如GC-MS、LC-MS/MS、HPLC/ICP-MS、LC-NMR、CE-ESI-MS等，它将分离、定量和定性融为一体。近年来，UH

12、PLC及其联用技术因其具有较高的分辨率和较快的分析速度使其在药物代谢研究中备受青睐33。在体内药物分析中，GC作为一种成熟的方法已发展到一个瓶颈期，新的技术革新主要着眼于色谱柱和原有仪器的改进以及便携式微型GC的发展。GC-MS由于EI离子源较难得到分子离子峰因而也面临着未知物测定的难题，利用HRAM-APCI-GC联用技术可以得到准确的分子离子峰，有效地解决了这一难题。近年来，二维气相色谱(GCGC)成为GC发展新的增长点，结合TOF/MS的联用技术，使之具有更高的灵敏度和分辨率，特别适合于中药复杂体系分析、兴奋剂检测以及临床和法医毒理学中的药物毒物分析34。新的LC与MS的联用技术层出不穷

13、，例如同位素标记/稀释技术可以拓展LC-ESI-MS的线性范围及降低基质效应;微喷雾和纳喷雾(nano-ESI)技术提高了微量样品分析的灵敏度;具有高通量、灵敏度和准确度的HPLC-MAL-DI/TOF-MS;能得到很多的碎片信息和更小的基质效应的LC-(coldEI)-MS技术;LC与线性离子阱(lineariontrap，LIT)质谱的联用，与三维离子阱相比，贮存离子能力提高，空间电荷效应有一定改善;在线分析中SPE与UPLC-QqLIT的联用;LC-Q-TOF，LC-TOF-TOF、LC-线性离子阱静电轨道阱联用质谱仪(LTQ-Orbitrap)等技术的应用将使得药物开发、药物代谢分析、

14、临床医学、毒物学研究以及蛋白质组学等方面的研究将更为广泛和深入3536。在这些技术中，接口是影响联用的一个关键因素，例如CE-MS最成熟的是电喷雾离子化接口(ESI)，新发展起来的无鞘流及低鞘流接口在分离效能和灵敏度方面表现出较大的吸引力，扩大了CE-MS的应用范围37。芯片电泳中激光解析离子化(LDI)接口也逐渐被应用，此外还有如CE-APEI-MS、CE-IT-MS、CE-API-MS等接口模式。代谢研究中的高分辨质谱技术新型高分辨质谱(HRMS)除了可得到所有待分析物质全扫描MS数据，其系统的精密度目前可与三重串联四极杆质谱相媲美，增强了其定量测定能力。而且HRMS可以得到超过预设质量范

15、围的信息，因而能够对未知待测物进行测定，这是他区别于传统多重检测研究代谢组学的一个特点。未来代谢组学的发展趋势将是利用MS特别是HRMS在更宽的质量范围收集全扫描数据，同时对代谢物进行定性和定量分析。尽管当前MS的检测灵敏度和耐用性得到了显著提高，但许多问题仍不能得到解决，今后还应更加关注代谢物离子的提取效率和仪器分辨率的提高。新型HRMS如LTQ-Orbitrap、傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR)的推出克服了以往TOF-MS在分析不同浓度待测物时质量准确度变化的缺点，并可在较大的动态范围内进行定量分析38。新的解吸附电喷雾离子化(DESI)技术几乎不需要样品前处理，利用喷雾解吸附、离

16、子化，并将待测物导入质谱仪，可用于生物样品中药物代谢物的原位测定。新型MALDI技术(例如硅胶解析以及纳米技术的研究)将更加减少基质对测定结果的干扰39。利用13C，15N和34S同位素标记结合HRMS，用于体内生物小分子、蛋白质以及核酸的检测，也是人们关注的焦点。代谢研究中的NMR利用NMR进行代谢产物特别是大分子物质的结构确证是研究代谢的另一重要方法。最突出的技术进步就是2D-NMR方法的发展。它从根本上改变了NMR技术用于解决复杂结构问题的方式，使NMR技术成为解决复杂结构问题的最重要的方法。2D-NMR的发展扩展了杂核磁共振(X-NMR)的研究，如1H-13CHSQC和1H-15NHS

17、QC等的广泛研究和使用40。近几年已出现3D-NMR技术来替代2D-NMR方法，用于生物大分子的结构测定。初步探索的结果表明3D-NMR方法可以同时检测13C，15N和1H之间的相互作用，能提供许多2D-NMR方法所不能提供的结构信息，从而简化结构解析过程41。近年来，一些新技术的出现也使NMR效能得到显著提高，例如更高的磁场强度、低温探针、微线圈探针、先进脉冲序列、同位素标记等。代谢研究中的CE技术CE技术在生物样品中大分子物质及其代谢产物的分析测定中具有显著的优越性。CE新技术为体内小分子的测定提供了有力工具，微芯片电泳、3D毛细管电泳、毛细管凝胶电泳(CGE)，以及在微流控芯片上构建多维

18、分析系统也为大分子物质的分离分析提供了新的技术平台。由于CE的灵敏度仍不够高，所以改进检测方法和样品富集技术一直是CE方法的研究重点21。体内药物分析中的前处理技术传统的生物样品处理方法主要是液液萃取、液固萃取以及沉淀等方法。分子印迹技术在色谱分离中由于其存在固有的色谱性能缺陷，使得其在定量药物分析领域应用受到限制，但在样品前处理领域仍有着广泛的应用前景。样品的前处理技术的发展趋势是用样量更少和选择性更高，如液相微萃取、固相微萃取技术、利用离子液体的微萃取技术、膜分离技术、碳纳米管技术、分子印迹技术等。而LC-MS的普及使在线固相萃取变得越来越重要。现今仍然面临两个挑战:一是色谱分离机制必须与样品成分的理化性质相契合;二是在第一维色谱中分离的样品成分不能在接下来的分离中损失。在中药常量元素和痕量元素的质量控制中，传统的原子光谱技术依然占据主导地位，但一些灵敏度更高，分析速度更快、专属性更好的技术(如ICP-MS)应用越来越多48。中药质量控制是中药发展的核心所在，多元化的中药质量控制方法和注重中药的系统化研究将是发展