生物工程方向实验亲和层析纯化胰蛋白酶

1、生物工程方向实验亲和层析纯化胰蛋白酶一、引言前面我们所学的凝胶过滤法、离子交换法以及电泳等一系列分离纯化生物大的，比起早期采用的盐析法，这些方法中，或是利用生物大及等电点沉淀法等，分离效果要好得多。但是，在一定条件下不同的溶解度、电荷分布、总电荷的不同，或是依据其的大小和形状的不同。一句话，多是利用生物间物理和化学性质的差异来进行分离纯化的。由于这些方法的特异性比较低，加之待分离物质之间的物化性质差异较小，常常要综合不同的分离方法。经过许多步骤才能使生物达到一定的纯度。这样既费时间，又费试剂，有时最后还不能令人满意。另外 ，有些生物大，往往在生物组织或发酵液中的含量很低，相对地说杂质很多，特别

2、是一些具有生物活性的，往往由于分离纯化的步骤很多，时间过长，造成破坏以致失活，产率很低。这就促使人们去寻求新的方法来解决存在的问题。亲和层析法是近十多年来迅速地发展并广泛被采用来分离纯化生物大的一种十分有效的方法。它具有分离快速，纯化效率高。特别是对于那些含量少，杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性，显示了独特的优越性。有时一次被分离物质的纯度可提高几倍，十几倍甚至几百倍。因此，亲和层析技术已成为纯化生物化生物活性物质最重要的方法之一。二、实验目的与要求，特别是纯1. 理解亲和层析法的基本原理，并通过实验能初步掌握方法；2. 理解和掌握亲和层析实验操作技术；3. 学会一种测定蛋白水解酶活力及

3、比活的方法。三、基本原理一种亲和吸附剂的操作简言之，亲和层析主要是根据生物与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物法。得以分离。这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方许多生物都有一种独特的生物学功能。即它们都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性（间通过某些次级键结合，如范德华力，疏水力，氢键等，在一定条件下又可解离）。如：酶和底物（包括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似物）的结合。特异性的抗体一抗原（包括、细胞）、激素与其受体、载体蛋白，与其互补 DNA、mRNA 及阻遏蛋白的结合，植物凝集素与淋巴细胞表面抗原及某些多糖的结合等。均属于专一性而可逆的结合。这种之

4、间的结合能力叫做亲和力。亲和层析正是利用生物间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。所以有人称为“生物专一吸附技术”或“功能层析技术”。在实际工作中，只要把被识别的，称为配基（Ligand），在不损害其生物学功能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上（Matrix, 如 Sepharose 4B）制成亲和吸附剂，1然后装柱。再把含有要分离纯化的物质的混合液通过这个柱子，这时绝大部分对配基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留，只有与配基互补的化合物被吸附留在柱内。当所有的杂质从柱上流走后，再改变洗脱条件，使结合在配基上的物质解离下来。这样，原来混合液中被分离的物质便以高度纯化的形式在洗脱液

5、中出现。本实验为了纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂，从胰脏粗提取液中纯化胰蛋白酶。鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂，对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用，但不抑制糜蛋白酶。在 pH = 78 的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合，而在 pH =23 时，又能被解离下来。因此，采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从胰脏粗提液中通过一次亲和层析直接获得活力大于 10,000 BAEE便得多。纯化效率可达到 10 20四、试剂与器材/ 毫克蛋白 胰蛋白酶制品，比用经典分离纯化方法简倍以上。主要试剂：烷 TrisCaCl2三氯乙酸HClNaOHNaClH2

6、SO4Na2CO3 氯代环氧丙KClSepharose-4B. 新鲜猪胰脏鸡蛋清乙酸 二氧六环每组需配溶液：1、亲和层析柱平衡液 1000ml：0.1mol/L pH = 8.0 Tris -HCl Buffer ,含 0.5mol/LKCl 、0.05mol/L CaCl2 。（配 1000ml：12.1g Tris，37.5g KCl，5.6g Cacl2 先将 tris 和 KCl 溶解后， 调 pH8.0，再加入 CaCl2）2、亲和柱解吸液 1000ml：0.1mol/L 甲酸0.5 mol/L KCl pH = 2.5 。（配 1000ml：37.5g KCl，4.35ml 甲酸）

7、。3、Sepharose 4B 胶液：A、0.5mol/L NaCl 300ml.B、0.2mol/L Na2CO3 缓冲液，pH = 9.5, 200ml.4、乙酸酸化水：200mL 蒸馏水，加乙酸调 pH 到 4.0全班共用溶液：1、10%pH1.0 三氯乙酸 500ml. （配制三氯乙酸：称取 50 克三氯乙酸，用 400 ml 蒸馏水溶解，再用 5mol/L NaOH 调 pH = 1.0 左右，最后加蒸馏水至 500ml。）2、酶活性测定所需溶液：A、0.05 mol/L pH = 8.0 Tris-HCl Buffer 含 0.2% Cacl2 1000ml（配 1000ml：6.

8、05g Tris 水溶后，先用 4mol/L HCl 调 pH 为 8.0，然后方可加 2g Cacl2 ）。B、0.001M HCl 500ml.C、BAEE 底物缓冲液 500ml：340mg BAEE溶于 500ml 0.05 mol/L pH = 8.0 Tris-HCl buffer 中，临用前配制，冰箱内可保存 3 天。3、调整 pH 用：A、5mol/L NaOH 200ml. B、5mol/L HCl 200ml.C、2.5mol/L H2SO4 200ml.4、Sepharose 4B 活化所需溶液：2A、2mol/L NaOH 100ml.B、56%二氧六环 200ml.主

9、要器材：恒温水浴，温度计，G2漏斗，抽滤瓶，布氏漏斗，离心杯（50ml），透析袋，层析柱（1×15cm），秒表，移液管，贮液瓶（1 升），电磁搅拌器，pH 计，紫外分光光度计，纱布，匀浆器，pH 试纸。五、实验操作步骤（一）鸡卵粘蛋白的分离及纯化1. 鸡卵粘蛋白（Ovomucoid）的一些性质:Ovomucoid 是一种糖蛋白，在中性及偏酸性溶液中对热及高浓度脲、均有较高的耐受性。但在较酸、碱条件下，易引起变性。 Ovomucoid 带有四种糖，此有较强的吸水性。在 50%或 5%三氯乙酸盐的水溶液中，仍有较好的溶解度。所以，选择合适的 pH，浓度和三氯乙酸盐的浓度，可以从蛋清中除去

10、大量的非卵粘蛋白。由于Ovomucoid 所带的糖基不泳行为呈现出不均一性，等电点在 3.9 4.5之间并呈现出四条电泳条带，但它们在生物学功能上差异不大，在氨基酸组成上几乎无差异，量约为 28,000。每 1 摩尔的卵粘蛋白能抑制 1 摩尔的胰蛋白酶。所以每毫克高纯度的卵粘蛋白能抑制约 0.84 毫克的胰蛋白酶。Ovomucoid 在 280nm 处的百分消光系数 A1%1cm 280 = 4.13. ， 即蛋白质浓度为 1mg/ml 时,溶液的吸光度 A280 = 0.413 ，据此可以测定其溶液中蛋白质的含量。2. Ovomucoid 的分离及粗品：1. 取 1 只鸡蛋，得蛋清约 30

11、ml ，将其温热至 25左右，加入等体积 10 % pH = 1.0的三氯乙酸溶液，这时出现大量白色沉淀。2. 充分搅匀后，测定溶液的pH 值，用5M HCl 或5mol/L NaOH 溶液调pH = 3.5±0.2 ， 注意在调 pH 值时，要严防局部过酸或过碱。3. 25放置 4 小时或过夜。4. 次日用 40006000 转/分 离心 20 分钟，收集清液，再用三层纱布过滤并检查滤液的 pH 值是否仍为 3.5±0.2，若不是，则要调回到此范围内。5.将清液放冰浴冷却至 0，缓缓加入 3 倍体积预先冷却的，用棒搅拌均匀并用薄膜盖好防止挥冰箱或冰浴中 3 4 小时6.

12、离心（ 3000 转/ 分，15 20 分钟）收集沉淀（清液留待回收）。将沉淀抽真空去净，得到粗的卵粘蛋白。7. 将粗卵粘蛋白用 20 ml 左右蒸馏水溶解。（若溶解后的溶液浑浊，可用滤纸过滤或离心去掉不溶物）。取上清装透析袋，并对蒸馏水透析过夜去除三氯乙酸8、将透析液精确调溶液 pH = 4.0 4.5，加入 3 倍体积预冷的沉淀，放冰箱或冰浴 3 4 小时，然后离心（3000 转/ 分，15 20 分钟）收集沉淀（清液回收）得鸡卵3粘蛋白（二）亲和吸附剂的目前有多种方法活化载体和偶联配基化载体与偶联配基。亲和吸附剂。本实验采用氯代环氧丙烷活1. 载体 Sepharose 4B 的活化 -

13、氯代环氧丙烷活化. 二氧六环溶剂活化1. 将合适大小圆形滤纸置于布氏漏斗中，以蒸馏水润湿，开真空泵使之充分贴附后，取 10ml 沉淀体积的 Sepharose 4B 于漏斗中，抽滤成半干，先用约 100 ml. 0.5mol/L NaCl 溶液淋洗，再用 100150ml 蒸馏水洗涤，以除去其中的保护剂和防腐剂。抽干约得6 克半干滤饼。2. 将滤饼置于 50ml 三角瓶中，加入 6.5 ml 2mol/L NaOH，2ml 氯代环氧丙烷及 15ml 56%二氧六环，并置于 40温和搅拌 2 小时。3、将胶转移到布氏漏斗中抽滤洗涤，先以蒸馏水淋洗除去多余的试剂，再用约 100ml0.2mol/L

14、 Na2CO3 pH = 9.5 缓冲液洗涤，最后将胶转入三角瓶中，接着尽快进行偶联实验。2. 鸡卵粘蛋白与活化的载体 Sepharose-4B 偶联1. 将已活化好的 Sepharose-4B 转移到三角瓶中。2. 用 10ml 0.2mol/LNa2CO3, pH = 9.5 缓冲液将上述好的卵粘蛋白溶解（或0.1mol/L NaOH 10ml 溶解），取出 0.1ml 溶液稀释 30 倍，用紫外分光光度计测定卵粘蛋白的含量。剩余的溶液全部转移到三角瓶中与活化好的 Sepharose 4B 偶联。在 40恒温摇床振荡 24 小时左右。3. 偶联终止后，将凝胶倒入布氏漏斗中抽干并用 100m

15、l 0.5mol/L NaCl 溶液洗去未偶联上的蛋白（收集滤液，测定滤液体积，测蛋白含量及总活力，以计算偶联率）, 再用100ml 蒸馏水淋洗。接着用亲和洗脱液（ 0.1mol/L 甲酸0.5mol/L KClpH = 2.5）50ml洗一次。最后用蒸馏水洗至中性，抽干后，将胶转移至三角瓶中，浸泡于亲和柱平衡液 0.05 mol/L CaCl2 0.1mol/L pH = 8.0 Tris -HCl 缓冲液中（浸没即可），放冰箱待用。环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基的偶联反应式及亲和层析示意图如下：4（三）亲和层析分离纯化胰蛋白酶1. 粗胰蛋白酶的取 100g 新鲜冰冻猪胰脏，剥去脂肪及结缔组

16、织后在匀浆中搅碎，加入约 200ml,预冷的乙酸酸化水（pH = 4.0）, 810条件下, 搅拌提取 45 小时 ，然后四层纱布挤滤收集滤液，用 2.5mol/L H2SO4 调 pH = 2.5.3.0，放置 12 小时（静置期间要检查一下 pH 值，应始终保持 pH = 2.53.0）,最后用滤纸过滤，收集滤液得胰蛋白酶粗提液，取 2ml 胰蛋白酶粗提液测定激活前的蛋白含量及酶活性。2. 胰蛋白酶原的激活：将滤液用 5mol/L NaOH 调 pH = 8.0，加固体 CaCl2 ，使溶液中 Ca²+的终浓度达到0.1mol/L。然后加入 2 5mg 结晶胰蛋白酶进行激活 ，于

17、室温下，20 25左右激活 2 4 小时（或 5冰箱放置 1820 小时进行激活）即可完成。用 2.5mol/L H2SO4 调至 pH = 2.5 3.0, 滤去 CaSO4 沉淀物，滤液放冰箱内备用。3. 亲和层析纯化胰蛋白酶：（1） 装柱：取一支层析柱，检查是否漏液，先充满亲和柱平衡液（0.1mol/L pH = 8.0,含 0.05mol/L CaCl2 的Tris - HCl 溶液），安上装柱漏斗。然后将亲和吸附剂轻轻搅匀，缓缓加入漏斗内，待其自然沉降均匀后，卸下漏斗，安上进样管并连接至恒流泵，泵入亲和柱平衡液平衡，调节流速 5ml / 2min 左右,（注意柱床不可干涸），检测流出

18、液至 A280 值小于 0.02 .（2） 上样：将胰蛋白酶粗提液用 5mol/L NaOH 调至 pH = 8.0,（若有沉淀，过滤去除之）。取一定体积上述澄清溶液上柱吸附。上样体积可大致计算如下：W ´ 0.84 ´1.3 ´104´1.5胰蛋白酶上样体积（ml）=C ´ A式中： W：是卵粘蛋白偶联的总 mg 数；50.84：是 1mg 卵粘蛋白能抑制约 0.84mg 胰蛋白酶；1.3×104 ：是纯化后胰蛋白酶比活的近似值； C：是胰蛋白酶粗提液的浓度（mg/ml）； A：是胰蛋白酶粗提液的比活（BAEE/mg）； 1.5：是

19、上样量过量 50% 。吸附毕，先用平衡液洗涤，至流出液 A280<0.02。换洗脱液洗脱。（3）洗脱及收集胰蛋白酶：用 0.1mol/L 甲酸0.5mol/L KCl pH = 2.5 洗脱液进行洗脱。洗脱速度约 5ml / 2min.，将流出洗脱液分管搜集，每管 5mL 左右，并测定其紫外吸收.将有紫外吸收峰的洗脱液搜集合并，测定其总体积，蛋白含量、酶的比活力及总活力。洗脱至流出液 A280<0.02，层析结束，测定层析柱床体积。亲和层析柱用平衡缓冲液平衡后可再次作亲和层析。若柱内加入防腐剂 0.01% 叠氮化钠 NaN3 在冰箱中保存，至少一年内活性不丧失。最后可用两种方法将纯

20、化的胰蛋白酶制成固体保存：（1） 将比活力最高部分用固体(NH4)2SO4 以 0.8 饱和度盐析，放置 4 小时以上，抽滤收集硫酸铵沉淀（要抽干）。滤饼先用少量蒸馏水溶解，再加入 1/4 体积 0.8mol/L pH = 9.0 的硼酸溶液，冰箱中放置, 数日后即可获得棒状结晶。（注：只有胰蛋白酶的量较多时， 才能得到结晶品）。（2） 将亲和层析获得的胰蛋白酶溶液放入透析袋內，在 4对蒸馏水透析，然后冷冻干燥成干粉。胰蛋白酶在亲和柱上的分离曲线六、实验结果处理1. 绘制亲和柱层析洗脱曲线。2. 计算鸡卵粘蛋白的比活力。63.4.5.计算鸡白的偶联量。绘制酶促反应动力学曲线（求初速度）。计算亲

21、和层析纯化胰蛋白酶的比活力及纯化效率。最后将亲和层析过程中的各项数据详细列入下表中。亲和层析实验数据附录一： 酶活力的测定1. 胰蛋白酶活力的测定：本实验以苯甲酰 L精氨酸乙酯（英文缩写为BAEE）为底物，用紫外吸收法进定。方法如下：取 2 个光程为 1 厘米的带盖石英比色杯，先在一只杯中加入 25预热过的 2.0ml 缓冲液（0.05mol/L pH = 8.0 Tris-HCl Buffer,含 0.2%CaCl2）。0.2ml 0.001mol/L HCl，然后再加 0.8ml BAEE-0.05mol/L pH = 8.0 Tris-HCl Buffer（含 0.2%CaCl2 和 1

22、mmol/L BAEE）作为空白，校正仪器的 253nm 处光吸收零点。再在另一比色杯中加入 2.0ml 缓冲液和 0.8mlBAEE 溶液，再加入 0.2ml 待测酶液，立即混匀并记时（。每半分钟读数一次，共读 34分钟。若DA253/min>0.400，则酶液应当稀释或减量，为宜。DA253/min 在 0.05 0.100 左右绘制酶促反应动力学曲线，从曲线上求出反应起始点吸光度随时间的变化率（即初速度）DA253/min。胰蛋白酶活力的定义规定为：以 BAEE 为底物，反应液 pH8.0，25，反应体积3.0ml，光径 1 厘米的条件下，测定DA253，每分钟使DA253 增加

23、0.001，反应液中所加入的酶量为一 BAEE所以：。7参数数据亲和柱床体积（ml）洗脱的胰蛋白酶溶液体积 ( ml )洗脱的胰蛋白酶溶液吸光值 A280洗脱的胰蛋白酶溶液蛋白浓度 ( mg / ml )亲和柱吸附率 ( mg / ml 凝胶)亲和柱洗脱酶液活力 ( u / ml )亲和柱洗脱酶液比活力 ( u / mg )上柱前样品比活力 ( u / mg )亲和柱纯化效率（倍数）DA253(min)0.001 ´ 酶液加入体积´ 稀释倍数胰蛋白酶溶液的活力（BAEE/ ml）酶液活力胰蛋白酶比活力（BAEE/ mg ）胰酶浓度(mgml)2. 卵粘蛋白抑制活性的测定的定

24、义：抑制一个胰蛋白酶活力（BAEE胰蛋白酶抑制活力）所需卵粘蛋白的量，定为抑制剂的一个活力（英文缩写为 BAEETIu）。具体测定方法如下：首先以底物（不加酶）于 253nm 处校正仪器光吸收零点 （操作如上述）；再测定标准酶的活力（操作如上述）；测定加入抑制剂后剩余酶活力；在比色杯中加入 0.2ml 标准酶液再加入适量的抑制剂（一般不能超过标准酶含量，以 1：2 左右为宜，具体视抑制剂的纯度而定），再加入 2.0ml 0.05mol/L pH = 8.0 Tris-HCl 缓冲液，摇匀后于 25放置 2 分钟以上，让酶与抑制剂充分结合。最后加入 0.8ml 底物（BAEE溶液），摇匀立即记时

25、，测定 A253 的变化。计算剩余酶活力按下面方程计算出抑制剂的抑制活力和抑制比活力：。DA0DAi ´ Ni抑制剂溶液的抑制活力 Iu（BAEE 抑制/ml）0.001ViIu（ BAEET Iu / mg抑制比活力 ）加入抑制剂蛋白浓度(mgml)式中：DA0：未加抑制剂时，酶每分钟DA253 增加值DAi.：加入抑制剂后，酶每分钟DA253 的增加值N i：抑制剂溶液的稀释倍数V i：测定时加入抑制剂的体积。附录二：猪胰蛋白和卵粘蛋白浓度的计算1. 猪胰蛋白酶浓度（mg/ml）= A280 ×( 1 / 1.35 ) ×稀释倍数2. 鸡卵粘蛋白浓度（mg/m

26、l）= A280 ×( 1 / 0.413 ) ×稀释倍数8附录三：活性测定加样顺序参照表注：测定胰酶活性时，酶的用量约 5 10 mg 。 测鸡卵粘蛋白抑制活性时，用标准胰蛋白酶。前几种溶液先反应 2min 后再加 BAEE。附录四： 实验安排：第一天：蛋清+等体积三氯乙酸沉淀去除杂蛋白，调 pH 至 3.5±0.2，放置过夜；第二天：离心，上清加三倍体积预冷透析过夜；，放 3 小时，离心，沉淀用 20ml 蒸馏水溶解后第三天：透析液调 pH 到 4.0-4.5，加三倍体积预冷沉淀 3 小时，离心收集沉淀；同时处理 Sepharose 4B，活化 2 小时后，偶联（沉淀用 10ml 0.2mol/L Na2CO3 缓冲液 pH = 9.5 溶解后，与活化了的 Sepharose 4B 偶联，注意偶联前留 0.1ml 鸡卵粘蛋白溶液测定浓度用）。提取猪胰蛋白酶，调整 pH2.5-3.0，放置 1 小时，过滤。第四天：调整 pH8，加钙，留 2ml 粗提液测比活用，激活 2-4 小时，中间等待时间可以配溶液，洗涤偶联好的 Sepharose 4B，测定洗涤液及昨天留下的鸡卵粘蛋白