酶活性测定(2024123852)

1、实验一植物抗氧化酶活性的测定植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、过氧化物酶POD等。它们普遍存在于植物的各种组织中，可以通过催化植物体内的活性氧，防止发生氧化反应。所以抗氧化酶活性与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系，经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。一、超氧化物岐化酶活性测定超氧物歧化酶SOD普遍存在于动、植物体内，是一种去除超氧阴离子自由基I 的酶，它催化以下反响：Q3，+2H+ 汨?田Qg+Q2_匚 Jmhq十6反响产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为

2、植物逆境生理学的重要研究对象。【原理】本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑NBT在光下的复原作用来确定酶活性大小。在有可氧化物质存在下， 核黄素可被光复原，被复原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生 ，可将氮蓝四唑复原为蓝色的甲 上二。后者在560nm处有最大吸收，而SOD可去除从而抑制了甲I"的形成。于是光复原反响后，反响液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之 酶活性愈高。一个酶活性单位定义为将NBT的复原抑制到对照一半50%时所需的酶量，据此可以计算出酶活性大小。【仪器与用具】高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯反响试管处光照强度为 4000IX; 试管数支；黑色硬纸套。【试剂

3、】1. 50mmol/L磷酸缓冲液。2. 提取介质磷酸缓冲液内含1 %聚乙烯吡咯烷酮。3. 130mmol/L甲硫氨酸Met丨溶液：称取 9g Met用磷酸缓冲液定容至 100ml。4. 750 口 mol/L氮蓝四唑NBT溶液：称取 61.33mg NBT用磷酸缓冲液定容至 100ml，现 配先用，避光保存。5. 100 口 mol/L EDTA-Na2 溶液：取 37. 21ng EDTA-Na 用磷酸缓冲液定容至 1 000ml。6. 20 口 mol/L核黄素溶液：取 7.53mg核黄素定容至1 000ml避光保存。【材料与方法】1. 酶液提取：取一定部位的植物叶片视需要定，去叶脉于预

4、冷的研钵中，加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，倒入 5ml离心管中，用提取介质冲洗研钵 23次，最后加 缓冲液使终体积为 5ml。于10 000r/min下离心10min，上清液即为 SOD粗提液。2显色反响：取试管要求透明度好7支，3支为样品测定管，3支为对照管，另外1支作为空白，按表1参加各溶液。混匀后将空白管置暗处， 其他各管于4000IX日光灯下反响20min要求各管受光情况一 致，反响室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长；温度范围30-37度。【结果处理】SOD活性测定与计算 至反响结束后，以不照光的作空白，分别测定其他各管560nm波长下的吸光度值，SOD活性单位以

5、抑制 NBT光化复原的50%为一个酶活性单位表示。 按下式计算SOD活性：-1SOD 总活性U g FW =式中 SOD总活性以每克鲜重酶单位表示; Ao照光对照管的吸光度值；As样品管的吸光度值；Vt样液总体积mlV1测定时样品用量FW样重g丨；ml；表1-1 各溶液参加量试剂酶测疋管用量ml空白和对照管用量ml磷酸缓冲液130mmol/L Met 溶液750 口 moI/L NBT 溶液100 口 moI/L EDTA-Na2 液20 口 moI/L核黄素酶液蒸馏水总体积加缓冲液【考前须知】1. 显色反响过程中要随时观察光下对照管的颜色变化，当A0到达时终止反响。2. 当光下对照管反响颜色

6、到达要求的程度时，测定管加酶液未显色或颜色过淡，说明 酶对NBT的光复原抑制作用过强，应对酶液进行适当稀释后再显色，以能抑制显色反响的 50%为最正确。3. 植物组织中的酚类物质对测定干扰，对酚类含量高的材料提取酶液时刻参加聚乙烯吡咯 烷酮PVPP消除之【思考题】1. 在SOD测定中为什么设照光对照管和暗中空白管？2影响本实验准确性的主要因素是什么？应如何克服？二、过氧化氢酶活性的测定采用滴定法【原理】H2C2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢， 使反响溶液吸光度A240 随反响时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。【仪器与用具】紫外分光光度计；离心

7、机；研钵；250ml容量瓶；刻度吸管；2ml刻度吸管；10ml试管； 恒温水浴锅；【试剂】1. 0.2mol /磷酸缓冲液内含1 %聚乙烯吡咯烷酮；2. 0.l mol/ L fQ :市售30% H2O2大约等于，取30% H2O2溶液，稀释至1000ml。用 / L高锰酸钾标定。【材料与方法】1. 酶液提取：称取剪碎的植物样品置研钵中，参加23ml 4 C下预冷的磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后， 转入10ml刻度试管中，并用缓冲液冲洗研钵 23次，合并冲洗液， 并定容到刻度，摇匀。取局部提取液在4 000r/min下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。2测定：取10ml试管4支，

8、其中3支为样品测定管，1支为对照管，按表2顺序参加 试剂。表1-2 各溶液参加量管号S1S2S3S0对照粗酶液mlml 蒸馏水ml0.2煮死酶 液25C预热后，逐管参加/ L的NQ,每加完一管立即记时， 并迅速倒入石英比色杯中 可在比色杯中直接加 H2Q，240nm下测定吸光度蒸馏水调零，每隔lmin读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。 【结果处理】以lmin内A240减少为1个酶活单位U。过氧化氢酶活性U/g FW/mi n=式中A。一参加煮死酶液的对照管吸光值；Asl , As2, A3 样品管吸光度值；Vt 粗酶提取液总体积ml；V1测定用粗酶液体积mlFW样

9、品鲜重g:A240每下降为1个酶活单位U:t 加过氧化氢到最后一次读数时间mi n。【考前须知】1. 所用KMnO4溶液及H2Q溶液临用前要经过重新标定。2. 凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。 【思考题】1 影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些？2. 过氧化氢酶与哪些生化过程有关？三、过氧化物酶活性的测定过氧化物酶POD通过催化酚类物质与 H2Q反响生成醌类来去除植物体内的H2Q。过氧化物酶还与生长素、 NADH、NADPH的氧化有关，在植物代谢中起着重要作用。【原理】愈创木酚邻甲氧基苯酚可作为过氧化物酶的底物，与H2Q反响生成茶褐色产物。 该物质在 470nm 处有最大吸收峰，故

10、可利用分光光度计测定过氧化物酶的活性。【仪器与用具】紫外分光光度计；离心机；研钵； 5ml 量筒； 25ml 容量瓶；微量进样器；秒表。 【试剂】1. 100 mmol L PH6.0 磷酸缓冲液。2. 反响混合液： 100 mmolL P50ml 于烧杯中，参加愈创木酚28卩L,于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，参加30%过氧化氢19卩L,混合均匀，保存于冰箱中。【材料与方法】1. 酶液的提取 称取剪碎的植物样品置研钵中，加适量的磷酸缓冲液和少量石英砂研磨 成匀浆后，将匀浆全部转入离心管中，以4000g离心10min，上清液转入25ml容量瓶。沉淀用5ml磷酸缓冲液再提

11、取两次， 上清液并入容量瓶， 定容至25ml，低温下保存备用。酶 浓度太高，样品数可少至 1g取两个光径1cm比色杯，于1个比色杯中参加反响混合液 3ml和磷酸缓冲液1ml，作为 较零对照；另一个比色杯中参加反响混合液3ml和粗酶液1ml(如酶活力过高可适当稀释)，立即开启秒表记录时间，于 470nm 进行比色测定，每隔 1min 记录一次吸光度值，共记录 5min，然后以每分钟内 阳。变化0.01为1个酶活性单位。【结果处理】以lmin内A470变化为1个酶活单位(U)。过氧化物酶活性U/g FW/min= A47ott式中 A470反响时间内吸光度的变化；V 为酶提取液总量 (ml)；V

12、为反响系统中参加的酶液量 (ml);W-样品重(g)：t 反响时间 (min) 。四 叶绿素含量的测定根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其 吸光度， 即可用公式计算出提取液中各色素的含量。 根据朗伯比尔定律， 某有色溶液的光 密度D与其中溶质浓度 C和液层厚度L成正比，即：D=kCL式中： k 为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm 时， k 为该物质的比吸收系数。 各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定浓度的纯物质 在不同波长下的光密度而求得。如果溶液中有数种吸光物质， 那么此混合液在某一波长下的总光密度等于各组分在相应波

13、长下光密度的总和，这就是光密度的加和性。测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、 b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的光密度D,并根据叶绿素 a、b及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、 b 时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。叶绿素 a、b 的 80%丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm 和 645nm ，又知在波长 663nm 下，叶绿素 a、 b 在该溶液中的比吸收系数分别为和，在波长645nm 下分别为和，可根据加和性原那么列出以下关系式：D663ab 1D645ab 2式1、2中的D663

14、和D645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的光密度，Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度，以mg/L为单位。解方程组1、 2，得：Ca663645 3Cb645663 4将 Ca 与 Cb 相加即得叶绿素总量CT：CT = Ca + Cb645663 5另外，由于叶绿素 a、 b 在 652nm 的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数均为， 也可以在此波长下测定一次光密度D652而求出叶绿素 a、b总量：Ct = D652 X 10C80/ 34.5 6在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。Lichtenthaler等对Arnon法进行了修正，提出了80

15、%丙酮提取液中三种色素含量的计算公式：Ca663 646 7Cb646663 8Cx-c= 1000D470a T04Cb/ 229 9式屮：Ca、Cb分别为叶绿素a和 b 的浓度；Cx-C为类胡萝卜素的总浓度；D663、 D646 和D470分别为叶绿体色素提取液在波长663nm、 646nm 和 470nm 下的光密度。由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时， 计算公式也有所不同。 叶绿素 a、b 在 96%乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm 和 649nm，类胡萝卜素为 470nm ，可据此列出以下关系式：Ca665 649 10Cb649665

16、11 12Cx- c= 1000D470ab/ 245【仪器与用具】分光光度计；研钵 2 套；剪刀 1 把；玻棒； 25ml 棕色容量瓶 3 个；小漏斗 3 个；直径 7cm 定量滤纸；吸水纸；擦境纸；滴管；电子顶载天平 1/100g 感量。【试剂】95%乙醇或 80%丙酮；石英砂；碳酸钙粉。【方法】1 取新鲜植物叶片或其他绿色组织或干材料，擦净组织外表污物，剪碎去掉中 脉，混匀。2. 称取剪碎的新鲜样品，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及23ml 95%乙醇或80%丙酮研成匀浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白， 静置35min。3 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒

17、把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。5. 把叶绿体色素提取液倒入比色杯内。以96%乙醇为空白，在波长 665nm、649nm和 470nm下测定光密度。6. 按公式10、 11、 12如用80%丙酮，那么按公式 7、& 9分别计算叶 绿素a、b和类胡萝卜素的浓度mg/L， 10、 11式相加即得叶绿素总浓度。7. 求得色素的浓度后再按下式计算组织中各色素的含量用mg/g鲜重或干重表示：色素的浓

18、度4"提职液体枳池稀释倍数叶绿体色素含量=- I附/ .匕，【考前须知】1. 为了防止叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些。2. 叶绿体色素提取液不能浑浊。可在710nm或750nm波长下测量光密度，其值应小 于当波长为叶绿素 a吸收峰时光密度值的 5%,否那么应重新过滤。3. 用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差 1nm,那么叶绿素a的测定误差为2%,叶绿素b为19%，使用前必须对 分光光度计的波长进行校正。 校正方法除按仪器说明书外，还应以纯的叶绿素 a和b来校正。4. 在使用低档型号分光光度计如：72型、

19、125型、721型等测定叶绿素 a、b含量时，因仪器的狭缝较宽，分光性能差，单色光的纯度低土57nm，与高中档仪器如岛津UV-120、UV-240等测定结果相比，叶绿素 a的测定值偏低，叶绿素b值偏高，a/b比值严重偏小。因此，使用时必须用高档分光光度计对低档的分光光度计进行校正。五 硫代巴比妥酸法丙二醛含量测定一：原理丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反响生成红棕色的三甲川 (3 , 5, 5三甲基恶唑-2,4。二酮)，其最大吸收波长在 532nmo 但是测定植物组织中 MDA寸受多种物质的干扰， 其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在 450nm但532nm处