植物组织中淀粉含量的测定

1、植物组织中淀粉含量的测定2007-01-1208:55I慈酮硫酸法一、原理淀粉是由葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖，然后在浓硫酸的作用下，使单糖脱水生成糠醛类化合物，利用慈酮试剂与糠醛化合物的显色反应，即可进行比色测定。二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料任何植物材料。（二）试剂浓硫酸（比重1.84）。9.2mol/LHClO4。2%意酮试剂，同实验24。（三）仪器设备电子天平，容量瓶：100mL4个、50mL2个，漏斗，小试管若干支，电炉，刻度吸管0.5mL1支、2.0mL3支、5mL4支，分光光度计，记号笔。三、实验步骤1.标准曲线制作取小试管11支从010编号

2、，按表24-3加入溶液和蒸储水。以下步骤按苯酚法或慈酮法均可，见方法一或方法二，绘制相应的标准曲线。表24-3各试管加入标准液和蒸储水量管号910淀粉标准液（ml）00.40.81.21.62.0蒸储水（ml）2.01.61.20.80.40淀粉含量（mg）040801201602002 .样品提取称取50100mg粉碎过100目筛的烘干样品，置于15mL刻度试管中，加入67mL80%乙醇，在80c水浴中提取30min,取出离心（3000rpm）5min,收集上清液。重复提取两次（各10min）同样离心，收集三次上清液合并于烧杯，置于85C恒温水浴，使乙醇蒸发至23mL,转移至50mL容量瓶，

3、以蒸储水定容，供可溶性糖的测定。向沉淀中加蒸储水3mL,搅拌均匀，放入沸水浴中糊化15min。冷却后，力口入2mL冷的9.2mol/L高氯酸，不时搅拌，提取15min后加蒸储水至10mL,混匀，离心10min,上清液倾入50mL容量瓶。再向沉淀中加入2mL4.6mol/L高氯酸，搅拌提取15min后加水至10mL,混匀后离心10min,收集上泊于容量瓶。然后用水洗沉淀12次，离心，合并离心液于50mL容量瓶用蒸储水定容供测淀粉用。3 .测定取待测样品提取液1.0mL于试管中，再加慈酮试剂5mL,快速摇匀，然后在沸水浴中煮10min,取出冷却，在620nm波长下，用空白调零测定光密度，从标准曲线

4、查出淀粉含量（mg）。四、结果计算：含量（）=100*C*VT/V1*1000*W式中：C从标准曲线查得淀粉量,mgV T样品提取液总体积，mL0V 1显色时取样品液量，mL1W样品重，g。0.9由葡萄糖换算为淀粉的系数n碘-淀粉比色法一、原理对于淀粉含量较少的植株样品，也可采用碘就粉比色法。淀粉在加热情况下能溶于硝酸钙溶液中，当碘化钾和硝酸钙共存时，碘能以碘求粉蓝色化合物沉淀全部淀粉。将此沉淀溶于碱液，并在酸性条件下与碘作用形成蓝色溶液进行比色。二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料任何植物材料。（二）试剂1 .80%硝酸钙溶液。2 .0.5%碘液：称5.00g结晶碘和10.00g碘化钾

5、，放入研钵混合干研，然后加10mL蒸储水研至全部碘溶解，将溶液全部转入1000mL容量瓶定容后，贮于磨口试剂瓶。</P>3 .5%含碘硝酸钙溶液：取10mL80%的硝酸钙溶液，加入160mL水再加入3mL0.5%的碘液混匀，现用现配。4 .标准淀粉溶液：称取纯淀粉50mg于研钵中，力口3mL80%硝酸钙溶液，研细并转移到100mL的三角瓶中，用15mL80%的硝酸钙溶液冲洗研钵，无损地收集于三角瓶中。将三角瓶置于沸水浴中煮沸5min,冷却后全部转入50mL容量瓶中并定容。此液为1mg/mL的淀粉标准液。5 .0.1mol/LNaOH。6 .0.1mol/LHCl。（三）仪器设备分析

6、天平，研钵，容量瓶，量筒，三角瓶，水浴，小漏斗，电炉，离心机，离心管，试剂瓶。三、实验步骤1 .称取13g叶片，剪碎放入研钵，力口5mL80%的硝酸钙溶液，研磨成糊状移入100mL的三角瓶中，用10mL80%的硝酸钙冲洗研钵，无损地收集于三角瓶中，瓶口盖上小漏斗，在沸水浴上煮沸35min（叶片含淀粉少的3min,含淀粉多的5min）,使样品中淀粉转变为胶体溶液。2 .给三角瓶中加20mL蒸储水，混合液转入离心管中离心（20003000rpm）23min,将离心后的淀粉胶体浑浊液移入100mL容量瓶（淀粉含量少时，可移入50mL容量瓶），三角瓶及离心沉淀物用510mL热蒸储水冲洗并同样离心，离心

7、液并入容量瓶中（共洗23次）定容，即为淀粉提取液。3 .取510mL淀粉待测液，加入到盛有2mL0.5%碘液的离心管中，混匀静置15min后离心（3000rpm）5min,弃上清液。沉淀用5%的含碘硝酸钙溶液冲洗两次，向冲洗后的沉淀中加入10mL0.1mol/L的NaOH混匀，将离心管浸入沸水内5min,使沉淀溶解。将溶液转入50mL容量瓶中，加入0.3mL0.5%碘液，用30mL左右的水冲洗并入容量瓶，加入2mL1mol/L的盐酸，用水定容并显色，在590nm波长处测定光密度。4 .绘制标准曲线取标准淀粉溶液（1mg/mL）0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于6个离心管中

8、，用80%硝酸钙溶液将各管的体积补足至5mL,再向各管加入2mL0.5%碘液，混匀静置15min后离心，其他操作同样品测定步骤，显色后在590nm波长下测定光密度。此系列溶液的淀粉含量分别为0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg,然后以光密度为横坐标，以淀粉含量为纵坐标绘制标准曲线。四、结果计算：含量（）=100*C*VT/V1*1000*W式中：C从标准曲线查得淀粉量，mgoV T样品提取液总体积，mL0V 1显色时取样品液量，mL0W样品重（g）。III旋光法（谷物淀粉含量的测定）一、原理：酸性氯化钙溶液与磨细的含淀粉样品共煮，可使淀粉轻度水解。同时钙离子与淀粉分子上的羟基

9、络合，这就使得淀粉分子充分地分散到溶液中，成为淀粉溶液。淀粉分子具有不对称碳原子，因而具有旋光性，可以利用旋光仪测定淀粉溶胶的旋光度（&,旋光度的大小与淀粉的浓度成正比，据此可以求出淀粉含量。溶提淀粉溶胶所用的酸性氯化钙溶液的pH值必须保持2.30,密度须为1.30,加时间的长短也要控制在一定范围。因为只有在这些条件下，各种不同来源的淀粉溶液的比旋度田才都是203°,恒定不变。样品中其他旋光性物质（如糖分）须预先除去。二、材料、仪器设备及试剂：（一）材料：面粉或其他风干样品（二）仪器设备：1.植物样品粉碎机；2.离心机；3.分析天平；4.粗天平；5.旋光仪及附件；6.三角瓶；

10、7.分样筛（100目）；8.布氏漏斗、抽滤瓶及真空泵；9.离心管；10.小电炉。（三）试剂：三、实验步骤：1 .样品准备：（1）称取样品：将样品风干、研磨、通过100目筛，精确称取约2.5g样品细粉（要求含淀粉约2g,请参考附注估计），置于离心管内。（2）脱脂：加乙醴数ml到离心管内，用细玻棒充分搅拌，然后离心。倾出上清液并收集以备回收乙醴。重复脱脂数次，以去除大部分油脂、色素等（因油脂的的存在会使以后淀粉溶液的过滤困难）。大多数谷物样品含脂肪较少，可免去这个脱脂手续。（3）抑制酶活性：加含有氯化高汞的乙醇溶液10ml到离心管内，充分搅拌，然后离心，倾去上清液，得到残余物。（4）脱糖：加80%

11、乙醇10ml到离心管中，充分搅拌以洗涤残余物（每次都用同一玻棒），离心，倾去下清液。重复洗涤数次以去除可溶性糖分。2 .溶提淀粉：（1）加醋酸氯化钙：先用醋酸氯化钙溶液约10ml加到离心管中，搅拌后全部倾入250ml三角瓶内，再用醋酸氯化钙溶液50ml分数次洗涤离心管，洗涤液并入三角瓶内，搅拌玻棒也转移到三角瓶内。（2）煮沸溶解：先用蜡笔标记液面高度，直接置于加有石棉网的小电炉上，在4min5min内迅速煮沸，保持沸腾15min17min,立即将三角瓶取下，置流水中冷却。煮沸过程中要时加搅拌，勿令烧焦；要调节温度，勿使泡沫涌出瓶外；常用玻璃将瓶侧的细粒擦下；并加水保持液面高度。3 .沉淀杂质和

12、定容：（1）加沉淀剂：将三角瓶内的水解液转入100ml容量瓶，用醋酸氯化钙溶液充分洗涤三角瓶瓶，并入容量内，加30%ZnS041ml混合后，再加15%K4Fe（CN）61ml,用水稀释至接近刻度时，力口95%乙醇一滴以破坏泡沫，然后稀释到刻度，充分混合，静置，以使蛋白充分沉淀。（2）滤清：用布氏漏斗（加一层滤纸）吸气过滤。先倾清溶液约10ml于此滤纸上，使其完全湿润，让溶液流干，弃去滤液，再倾清溶液进行过滤，用干燥的容器接受此滤液，收集约50ml,即可供测定之用。4 .测定旋光度：用旋光测定管装满滤液，小心地按照旋光仪使用说明，进行旋光度的测定。淀粉（）=aXNX100/20向祖XWK）M00

13、式中：0c用钠光时观测到的旋光度；m20D:淀粉的比旋度，在这种方法条件下为203°L:旋光管长度（cm）;W:样品质量（g）;K:样品水分含量（%）;N:稀释倍数；100:换算为百分率。也可以不用上列公式计算，改用工作曲线来求得淀粉含量，这样准确度高些。田、淀粉含量的测定目的掌握植物组织中淀粉含量测定的原理和方法。二、原理淀粉用盐酸水解转化成葡萄糖后，测定葡萄糖含量，根据葡萄糖含量换算成淀粉含量。三、材料、仪器设备及试剂材料、仪器设备及试剂与上述蔗糖的测定相同，另增加碘试剂；100ml、250ml容量瓶。碘试剂（碘化钾一碘溶液）的配制：称取碘化钾20g及碘10g溶于100ml蒸储水

14、中。使用前需稀释10倍。四、实验步骤1 .葡萄糖标准曲线制作与上述还原糖含量测定相同。2 .淀粉的水解取上述还原糖含量测定中经85%乙醇浸提后的全部淀粉残渣，放入100ml三角瓶中，加入6mol-L1盐酸10ml,混匀，在沸水浴中加热10min-30min（用碘试剂检查淀粉水解程度，直至不显蓝色为止），再加蒸储水20ml,摇匀并过滤于100ml容量瓶中，过滤后残渣再用蒸储水冲洗3次，一并过滤入容量瓶，定容至100ml。准确取出10ml过滤液置入250ml容量瓶中，加酚酗：2滴，用10%NaOM和至微红色，用蒸储水定容至250ml,待测。3 .还原糖含量测定取4支25ml刻度试管，编号，其中3支（三个重复）分别加入待测液2ml,1支空白管加2ml蒸储水代替样品液，然后各管再加入DNS试剂1.5ml,摇匀，混合液在沸水浴中加热5min,然后用自来水