时间分辨技术的原理最新资料全

1、时间分辨技术的原理目前最先进的免疫检测技术：1、时间分辨原理：用三价稀土离子及其鳌合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标 记蛋白质、多胎、激素、抗体、核酸探针或生物流行性细胞，当反应体系发生 后，用时间分辨仪器测定最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度 比值，来判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的。2、时间分辨原子标记物的特点：发射光和激发光有较大的 STOKE位移一一高特异性 长寿命荧光，降低其他物质的荧光干扰一一高灵敏度 半衰期长达几十万年，试剂受干扰小高稳定性原子标记与大分子标记物的对比原子标记物大分子标记物标记位点多个,可达20个只有1个对被标记物蛋白活性的影响

2、影响小，基本无影响影响大,经常影响蛋白活性对被标记物空间结构的影响无影响,保证稳定性影响大，造成试剂的不稳定受环境因素的影响影响小影响大,温度影响3、波长分辨：标记离子的荧光激发光波长围较宽，发射光光谱围较窄，是类线光谱，有利 于降低本底荧光强度，提高分辨率。激发与发射光之间有一个较大的 STOKE位移，有利于排除非特异荧光的干扰， 增强测量的特异性。4、时间分辨: 标记离子螯合物产生的荧光强度高，寿命长，有利于消除样品及环境中荧光 物质对检测结果的影响。每一秒名检测样品1000次，取其中不受干扰的400次的均值作为测定值，有 利于提高检测的准确性。时间分辨技术取代酶免、放免是免疫检测技术发展

3、的必然趋势！RIA （放免）放射性（1251），对环境和身体的危害，已经为重视环保的国家逐步取消，如 整个欧洲仅尚存几个放免试验室。125I半衰期短，导致试剂的有效期短，需每次定标，造成很大的浪费。由于标记物（125I ）的不断变化，带来药盒批间、批较大的变异，标准曲线无 法保存备用。ELESA（酶免）灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性、重复性不好。与其它技术的相对优势：（1）、是现有的免疫检测方法中灵敏度最高的（2）、是现有的免疫检测方法中稳定性最好的（3）、多标记检测是目前所有免疫检测技术中独一无二的TRF技术与电化学发光的比较时间

4、分辨荧光电化学发光标记物四种原子：Eu,Sm,Te,Dy一种原子：钉多标记技术有无科研项目能（1000多种科研项目）无试剂种类58种临床,24种科研,共82种40种临床，无科研试剂价格低高TRF与化学发光的比较时间分辨荧光化学发光发光效率95%1%重复检测可无数次重复不可重复本底噪声零本底干扰大灵敏级数10-1910-15标记物原子大分子化合物标记位点每个抗体可达20个1个标准曲线稳定达一年以上稳定2到4周多标记有,最多可达四标记无科研开发有无时间分辨荧光免疫定量分析简介时间分辨荧光分析（Timeresolved Fluoroimmu noassay,TRFIA是一种非同位素免疫分 析技术，它

5、用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测 量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非异荧光的干扰，极提高 了分析灵敏度。解离增强镧元素荧光免疫分析是时间分辨荧光免疫分析中的一种。它用具有双功能基团结 构的螯合剂，使其一端与铕（Eu）连接，另一端与抗体抗原分子上的自由氨基连接，形成EU 标记的抗体/抗原，经过免疫反应之后生成免疫复合物。由于这种复合物在水中的荧光强度非 常弱，因此加入一种增强剂，使Eu3+从复合物上解离下来，自由Eu3+同增强剂中的另一种螯 合剂螯形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光，信号增强了百 万倍

6、。因为这种分析方法使用了解离增强步骤，因此称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。乙肝病毒（HBV标记物的检测方法常用测定乙肝病毒的抗原、抗体标记物，由0年代末 70年代初的琼脂扩撒法，依次发展为血凝法-酶联免疫吸附（ELISA、同位素免疫标记（RIA） -化学发光免疫分析、生物发光、电化学发光免疫标记和0年代中建立的稀土离子荧光标记 （时间分辨荧光免疫分析）等不同的检测方法。随着科学的发展和检验技术的进步，其方法每 发展一步，乙肝标记物检出的灵敏度和准确性都得到不同的提高。时间分辨荧光免疫分析（TRF为近年新研制成功的用三价稀土离子作为示踪物，以单克 隆抗体包被支持物与样品中抗原反应，再加入有铕E

7、U标记的抗体，进行反应检测，可大大 降低一般同位素和荧光标记受环境干扰缺点，提高了检测的灵敏度和准性，TRF法检测乙肝 病毒标记物较其他方法灵敏度高、特异性好，干扰因素少TRF为目前检测乙肝病毒标记物最 理想的方法。TRF定量检测乙肝病毒“两对半”为临床诊断乙肝提供了新手段，有助于临床客观的分析HBV感染情况、疗效的观察和转归等情况的分析，至少可对下列情况更具有独特的诊断价值:1治疗前进行病毒定量检测，可以指导选择抗病毒药物，避免盲目用药。2、治疗后定量间接判断体病毒数量，有助于疗效的观察。3、怀孕前进行定量测定，有助于选择有利于的怀孕时机。乙肝孕妇进行定量检查，有助于使 部分病人得到及时的正

8、确的诊断目前我科已正式开展了乙肝二对半的TRFIA定量分析，其每一项的正常值围均是由我国卫 生部根据美国雅培的标准而制定其灵敏度，准确度,及精确度都有远远优于一般的ELISA法， 乙肝两对半的定量制定将给临床提供一个关于乙肝诊断及疗效，预后判断的更可靠的实验结 果。1 极提高了检测的灵敏度时间分辨荧光免疫定量技术（TRFIA检测HbsAg灵敏度可达0.2ng/ml,而酶标（EIASA检测的灵敏度是2ng/ml,极提高检测的灵敏度。因此，在急性乙肝 早期能及早检出HbsAg确证HBV感染，缩短窗口期；其次，可发现低浓虔bsAg携带者；在 部分慢性乙肝患者中，由于机体缺乏对HBV包蟆蛋白的免疫应答

9、,HbsAg表达较低，酶标检测 可出现HbsAg和HbsAb匀阴性的情况，TRF技术则可避免这些情况的发生，为正确判断病情提 供依据。2、能动态观察疗效和监测病情1）定量分析HBsA研口 HBsA的浓度变化,可预见急性乙肝是否处于恢复期如HBsAg 浓度降低，HBsAI浓度逐渐升高，可说明病情正往恢复期发展；反之，BsAg浓度处于较高水 平或上升趋势，而HBsAt一直处于较低水平，则易发展为慢性乙肝或病毒携带者。2）定量分析HBeA丙口 HBeA的浓度变化，可反映病情变化和治疗效果。定量测定能 明确检测HBeA和 HBeA转换的时期，即表现为HBeA浓度下降和HBeA升高的过程。高浓 度的HB

10、eA还可间接提示病毒处于高复制状态具有较高传染性。高浓度的HBeA一方面提示病情好转而在某些时候（如肝功能指标很差）则可能与肝坏死、肝硬化、肝癌有关3）HBcAb浓度的高低可反映病毒感染的状态。高浓度的抗Hbc提示乙肝性感染，恢复期浓度降低。慢性乙肝呈抗& Hbc持续高浓度。而低浓度的抗&Hbc 般为恢复期或既往感染。4）有利于对慢性肝炎活动性或非活动性的判断。非活动性慢性乙肝各项指标相对稳定， 活动性往往呈现进行性变化。3、TRFIA和定量PCR技术可互相补充血清HB DN荧光定量PC测定可以直接反映血液中病毒复制状态具有很多临床应用价值， 但不能完全反映病毒复制静息期肝细胞

11、HBV病毒状态。HBDNA阴性并不完全代表体HBV2被 清除，结合“两对半”各项指标更能客观反映体HBV病毒状态。4、HBsA 的定量测定能够对乙肝的预防起到监督作用HBsAb的定量测定能够对抗体是否真正具有“中和”BV勺免疫力作出正确评价，对乙肝的 预防起到监督作用。HBsAb的含量在10mlU/ml以上病人ELISA检测即可呈阳性结果，但并不提 示机体都一定具有免疫力，而HBsAb勺含量在10100mlU/ml之间的样本，定性虽为“阳性” 但此时机体对HBV勺免疫力较弱，甚至不能预防HBV感染。只有HBsAt的含量达到100mlU/ml 以上时才可确定具有抵抗HBV入侵的作用。作定量检测，

12、可根据HBsA啲含量判断机体对HBV 的免疫状态及乙肝苗的免疫效果。因此定量测定对乙肝疫苗免疫力的评价和高危人群预防免疫 具有重要意义，特别是在少年儿童预防乙肝方面。乙肝两对半定量的临床意义1、乙肝表面抗原(HBsA)定量能极早地检出HBsAg确证乙肝感染，几乎能与)reSI同时检测出。在乙肝病程大缩短 了窗口期的时间。由于机体常缺乏对包膜蛋白的免疫应答，BsA表达较低，可出现HBsAg An ti-HBs均 阴性的情况，定量检测HBsA则可避免这些情况的出现。病毒发生变异后，病毒表达量较低，甚至“定性”检测不出抗原。可检测HBsAg并 极有可能同时检测出HBsAg Anti-HBs。国外学者

13、研究表明HBsA®勺细胞免疫应答与肝细胞损伤有一定关系。血清中HBsAc含 量和病人对HBsA/田胞免疫成反比关系，而肝功能改就则与此种细胞免疫成反比。而定量 检测HBsA是反映这一关系的唯一手段。一般来说，慢性肝炎HBsAgCOffi对恒定：而活动性肝炎HBsAgC(往往较高且不稳定。2、乙肝表面抗体(An ti-HBs)定量Anti-HBs的定量检测能够地机体是否真正具有“中和HBV免疫力作为正确评价，避 免误误导病人，对乙肝的预防起到监督作用。An ti-HBs含理在10-1OOIU/L之间的样本，乙肝两对半定性的结果为阳性，但此时机 体对HB并无中和作用，仍有感染HBV勺危险

14、。只有定量检测An ti-HBs在100UI/L以上时 才具有抵抗HBV入侵的作用。因此，定量检测乙肝两对半对乙肝疫苗免疫力的评价和高危 人群预防具有重要意义。3、乙能e抗原(HBeA)定量HBeA是乙肝病毒在肝细胞在繁殖时出现的IC/C基因的产物，经蛋白酶水解后HBeg 白质以非颗粒形式分泌入血清中。在急性HBV感染时，血清中可出现HBeAg但维持可测水 平的时间很短暂（数天一数周）HBeAg日性一般是提示有大量病毒存在，是急性乙肝恢复 期的首选血清学指标。由前C基因突变HBV感染所致的急性或慢性乙肝，始终不出HBeAg但HBV-DNS行性 复制。HBeA亦在高CO水平波动。与前者HBeA阳

15、性慢性乙肝类型中的转换期比较，两对 半定性均表现为小三阳，但后者主要表现在哥BeAgC（值，忽高忽低的ALT值和HBV-DNA 始终阳性。4、乙肝e抗体（An ti-HBe定量由HBV野型株感染所引起的急性或慢性乙型肝炎，其自然史分为HBeAg阳性期和 Anti-HBe阳性期。定量监测能明确出HBeA向Anti-HBe换的时期，即表现为HBeAgCOI 降（含量降低）和Anti-HBeCO下降（含量升高）的过程。因此,Anti-HBe定量与HBeAg 定量联合检测对监测HBV感染的病程及药物的疗效观察有很好的实际意义。由前C基因突就株HBV感染所致异型慢性乙肝，由于患者始终不出珊BeAg因此，

16、长 期监测患者An ti-HBe含量对判断其预后和转归具有十分重要的价值。5、乙肝核心抗体 Anti-HBc）定量乙肝病毒由外壳HBsA和核HBeA组成。乙肝病毒感染期间，一般会产生An ti-HBc, 在HBeA出现后即可从血清中检测到。偶尔也有nti-HBe阴性的HBV感染者，多见于免疫 抑制的病人。在乙肝感染康复者HBsAg携带者中，Anti-HBe可长期存在。因此，在特殊人群中开展 An ti-HBe筛选试验对预防乙肝的传播有重要参考价值。An ti-HBe定量怀其他HBV式验一同检测有助于乙肝感染的诊断和监测。在其他指标缺 乏的情况下（如HBsA阴性），Anti-HBe定量可能是现存

17、HBV感染的唯一指标时间分辨免疫荧光法检测乙型肝炎病毒标志物临床工作中发现少部分经酶联免疫吸附法ELISA检测仅乙型肝炎表面抗原HBsA) 和抗HBc IgG阳性的患者，病毒含量却很高。为此，采用时间分辨免疫荧光分析法TRF对 34例此类患者进行乙型肝炎标志物HBV M的检查，现将结果报道如下：一、资料与方法1. 病例选择：为2002年2月至9月住院或门诊患者，共34例，男21例，女13例，年龄 558岁，平均(29.2 ±18.7)岁。采静脉血分离血清，用ELISA进行HB标志物(HBV M检 测及HBV DN定量检查。留取血清置30C保存。(1) HBsAg抗HBc IgG阳性，

18、乙型肝炎e抗 原(HBeAg 抗-HBs 抗-HBcIgM阴性；(2) HBNDNA含量104拷贝/ml; (3)近3个月未使 用抗病毒药物。每人进行2次抗原抗体检查，结果一致。2次HBV DN检查，结果相差1个数 量级以下。2. 常规HBV M检测：用ELISA法，试剂为科华生物工程股份产品，按产品说明书操作。3. HBV DNA含理测定：采用实时荧光定量PCR法，试剂盒购自医科大学达安基因诊断中 心。仪器为美国Perkin Elmer公司Gene Amp E57型PCR仪。严格按说明书操作，检测灵 敏度为103拷贝/ml。4. TRF法检查HBVM试剂为新波生物技术产品，采用Xnytest

19、2000时间分辨检测仪。严 格按照说明书操作。5. 统计分析：取HBV DN含量的对数值进行成组设计的两样本均数比较，行检验。二、结果1. HBV M :用TRF法检查发现,34例患者中HBsAgHBeAg抗-HBc阳性者15例，HBsAg 抗-HBe抗-HBc均阳性者14例，仅HBsAg 抗-HBc阳性者5例。即用ELISA检查时HBeAg 假阴性15例，抗-HBe假阴性14例(表1)。2. HBV DNA含量：HBeA及抗-HBc均阴性组、HBeA©日性组、抗HBc阳性组HBV DN含 量的对数平均值分别为645±1.74、7.29±1.59、5.80

20、7;1.46。将前者与后两组分别进行成 组设计的两样本均数比较的t检验，t值分别为1.005、0.816, P值均0.05,差异无显著 性。三、讨论HBV M勺变化是评估HBV感染后病情转归的重要依据，也是抗病毒治疗的疗效考核指标 之一。通过TRF佥查发现,大部分ELISA法检测为HBsA抗-HBc阳性模式的患者其实为HBeAg 假阴性（15/34, 44.12%及抗-HBe假阴性（14/34, 41.18%。仅少部分可能为病毒变异的 结果。研究发现，HBsAg 抗-HBc浓度显著高于正常，ELISA及 TRF符全率为100%抗-HBs 浓度明显低于正常，两者符合率为00%而HBeAg抗HBe

21、浓度仅稍高于正常，因此ELISA 易出现假阴性。目前TRF主要用于激素的检测。随着仪器及试剂的国产化，检测费用的降低， TRF因其突出的高敏感性、特异性强、无放射污染等特点，在HBV M勺检测中有着广泛的应 用前景。作者单位:410011中南大学湘雅二医院肝病研究中心目前我院已正式开展了乙肝二对半的时间分辨定量分析，其每一项的正常值围均是由我 国卫生部根据美国雅培的标准而制定，其灵敏度，准确度，及精确度都有远远优于一般的ELISA法，乙肝两对半的定量制定将给临床提供一个关于乙肝诊断及疗效，预后判断的更可 靠的实验结果。时间分辨荧光免疫定量测定乙肝两对半的临床意义极提高了检测的灵敏度时间分辨荧光

22、免疫定量技术TRFIA检测HBsA灵敏度可达0.2ng/ml,而酶标（EIASA 检测的灵敏度是2n g/ml,极提高检测的灵敏度。因此，在急性乙肝早期能及早检出HBsAg确 证HBV感染，缩短窗口期；其次，可发现低浓度HBsA携带者；在部分慢性乙肝患者中，由 于机体缺乏对HBV包膜蛋白的免疫应答,HBsAg表达较低，酶标检测可出现HBsAgffi HBsAb 均阴性的情况，TRF技术则可避免这些情况的发生为正确判断病情提供依据。能动态观察疗效和监测病情1 ）定量分析HBsA丙口 HBsA的浓度变化，可预见急性乙肝是否处于恢复期。女HBsAg 浓度降低，HBsA浓度逐渐升高，可说明病情正往恢复

23、期发展；反之HBsA浓度处于较高水 平或上升趋势，而HBsA一直处于较低水平，则易发展为慢性乙肝或病毒携带者。2 ）定量分析HBeA和HBeA的浓度变化，可反映病情变化和治疗效果。定量测定能明确 检测HBeA向 HBeA转换的时期，那表现为HBeA浓度下降和HBeA升高的过程。高浓度的 HBeA还可以间接提示病毒处于高复制状态具有较高的传染性高浓度的HBeA一方面提示 病情好转，而在某些时候（如肝功能指标很差）则可能与肝坏死、肝硬化、肝癌有关。3 ） HBsAI浓度的高低可反映病毒感染的状态高浓度的抗-Hbc提示乙肝急性感染，恢复 期浓度降低。慢性乙肝呈抗Hbc持续高浓度。而低浓度的抗Hbc般

24、为恢复期或既往感染。4 ）有利于对慢性肝炎活动性或非活动性的判断。非活动性慢性乙肝各项指标相对稳定, 活动性往往呈现进行性变化。 TRFIA和定量PCR技术可互相补充血清HBDNA荧光定量PCF测定可以直接反映血液中病毒复制状态具有很多临床应用 价值,但不能完全反应病毒复制静息期细胞HBV病毒状态°HBDNA阴性并不完全代表体HBV 已被清除，结合“两对半”各项指标更能客观反映体HBV病毒状态。 HBsA的定量测定能够对乙肝的预防起到监督作用吗？HBsA的定量测定能够对抗体是否真正具有“中和HBV勺免疫力作出正确评价，对乙肝 的预防起到监督作用。HBsA的含量在100mlU/ml以上

25、病人ELISA检测即可呈阳性结果，但 并不提示机体都一定具有免疫力，而HBsA的含量在10-100mlU/m之间的样本，定性虽为 “阳性”，但此时机体对HBV勺免疫力较弱，甚至不能预防HBV感染。只有HBsA的含量达到 100mlU/ml以上时才可确定具有抵抗HB入侵的作用。作定量检测，可根据HBsA的含量判 断机体对HBV勺免疫状态及乙肝疫苗的免疫效果。因此定量测定对乙肝疫苗免疫力的评价和 高危人群预防免疫具有重要意义，特别是在少年儿童预防乙肝方面。时间分辨荧光免疫分析在乙肝的应用中南大学湘雅二医院肝病研究中心教授：旭乙肝抗原体测定是诊断乙肝最常用的方法。酶联免疫测定由于操作简便，成本低廉，

26、敏感性和特异性较好，80年代中期以来就成为乙肝抗原体检测最主要的方法。但是本法只能定性， 作为定量测定的方法，其重复性很差。据观察，不同乙肝感染者表面抗原的浓度相8差0倍,e 抗原的浓度相差100倍，仅用“阳性”来表示，实在太粗糙，太不科学，难以满足临床的需要。 观察指标的量化是提高诊断水平的基本要求，也是科学发展的必然趋势，因此，进入0年代 以来，国外先后推出第四代检测方法：化学发光法、电化学发光法。但是这两个方法需要昂贵 的设备，试剂成本高，难以普遍应用。为了满足临床的需要，根据国情和省情，我科瞄准抗原抗体检测发展的方向2002年 10月引进具有世界先进水平的时间分辨荧光免疫检测仪在省率先

27、建交时间分辨荧光免疫分析（TRFIA检测乙肝抗原抗体的新方法，我院也是国少数应用本法检测乙肝的医院之一。时间 分辨荧光免疫分析的原理和通常的免疫测定方法基本相同，只是标记物和测定方法不同。时间 分辨荧光免疫分析以三价稀土离子（常用的是铕）及其螯合剂代替同位素、荧光素或酶，作为 标记抗原或抗体的示踪物，检测未知的抗体或抗原，用特制的时间分辨荧光仪测定最后反应产 物中荧光的强度，根据荧光强度来判断待测物质的浓度。在免疫复合物中的稀土离子自身可产 生微弱的荧光信号，而当加入增强液以后，稀土离子从免疫复合物中释放出来，受到激发光照 射时，荧光强度可增强100万倍。稀土离子发出性荧光不仅光度强，而且寿命

28、长。反应系统中 许多物质也可以发出荧光，但他们的荧光的寿命极短，因此，通过简单的延时检测，就可以将 特异性荧光与非特异性荧光区别开来，所以这个方法的名称冠以“时间分辨”时间分辨荧光 免疫分析是一种超灵敏的高度特异性的检测技术，是今后抗原抗体检测发展的方向，其灵敏度 比化学发光和电化发光高10倍100倍，比放免法和酶标法高1000倍以上。据我科现场测评， 其特异性、敏感性和重复性均极强，几乎没有假阴性，假阳性率低于.1%同一标本连续20 次检测C火1%同一批（10个）连续3天检测CV=0.9%检测后反应板连续3天重复阅读CV这一方法的建立必将极大的提高我科的乙肝诊断水平，使我们对乙肝感染者的病情

29、、预 后、病毒复制程度、抗病毒药物的疗效等的判断更变科学。乙肝时间分辨荧光免疫分析试剂盒 共5项，包括表面抗原、表面抗体、e抗原、e抗体和核心抗体，可任选1项或多项，全套需 备血3ml（不加抗凝剂），记账后（每项45元）标本送传染科实验室，当天下午出结果。时间分辨荧光免疫测定技术在HB M定量检测及临床应用分析【摘要】目的研究乙肝病毒感染者血清免疫学标志物，利用时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA检测其含量结果与ELISA法结果的任合程度、灵敏度、特异性；了解TRFIA测定 HBV-啲准确性、可行性及临床应用价值。方法分别用TRFIA和ELISA法测定260例随机血 清标本HBV-M结果及含量

30、。结果HBsAg( ELISA)阳性36例,TRFIA阳性40例,x2=4,Pv0.05, 两法符合率98.46%抗rHBs(ELISA阳性性130性，TRFIA阳性160例，x2=30, PV0.01，两法 符合率88.5% HBeAg(ELIS阳性 17例,TRFIA阳性 18例,x2=1, P>0.05,两法符合率99.6% 抗-HBe(ELISA阳性性86例，TRFIA阳性73例,x =6.76, PV0.01，两法符合率90.4% 抗 -HBc(ELISA阳日性 54例,TRFIA阳性 72例,x2=15.6 , PV0.01,两法符合率91.5% 结论TRFIA 法与ELIS

31、A法比较，特异性、敏感性都高,TRFIA乍用于HBV-M含量检测可为临床间接反映 病毒的感染状况，同时也为临床疗效提供动力学观察及接种乙肝疫苗提供依据。关键词HBV-时间分辨荧光免疫分析技术酶联免疫吸附试验【文献标识码】A【文章编号】1606-8106(2004 06-0486-02The time-resolved fluoroi mmuno assay TRFIA used in theHBV-M rati on test and the an alysis on cli nical applicati onCai Y iheDepartme nt of Laboratory,Chaozh

32、ou Cen tral Hospital,Gua ngdon g521021.【Abstract Objective to study the substanee of blood immunity HBV-M,Applyi ng,the tech no logy of TRFI-A to test the result and the n compare itwith the result of the ELISA in fixness,sensivity and specificity and to compre-hcnd the accuracy,feasibility and the

33、value of cli nical applicati onin testi ng HBV-M byTRFIA.Metfodsto deter-minate the result andcontent of260andHBV-My TRFIAandELISA2respectirely.Results HBsApositre is36by ELISA,and40byTRFIA,x=4,Pv0.05,the fix2rate is98.46%;anti-HBs positive is130by ELISA,and160by TRFIA, x =30, Pv0.01 ； the fix rate

34、is88.5%; HBeApositive is17by ELISA,and18byTRFIA,x2=1, P>0.05; the fix rate is99.6% ; Anti-HBe positive is86by ELISA,and73by TRFIA, x2=6.76, PvO.01, the2fix rate is90.4% ; Anti-HBc positive is54by ELISA,and72by TRFIA, x=15.6 , Pv0.01, the fix rate is91.5%.Con-clusion TRFIA has higher specificity a

35、nd sensitivity than ELISA,TRFIA in test ing HBV-M content may in directly n eflect the virus in fecti on in clinicaland offer dynamics observation in the clinical iffects and basis inino culatio n a-ga inst HBV.Key words HBV-M TRFIA ELISA时间分辨荧光免疫测定技术在HBV-M定量检测及临床应用分析目前国临床实验室最常用的乙型肝炎病毒H BV感染者的血清学标志物检

36、测主要靠ELISA法，由于ELISA法简单、方便、快速的优点在临床得到广泛应用，但受方法学本身的限制, 它不能提供HBV-的具体含量，只能作为阴阳性判断,故不可能完成HBV感染的动力学观察， 而时间分辨荧光免疫技术的出现提供了对HBV-M4行定量检测的手段。本文采用TRFIA法对 260份血清标本进行HBV-M检测，并与ELISA法结果进行比较和分析。现报告如下：1对象与方法1.1对象血清标本均来自本院门诊及住院病260例，无年龄性别要求。早晨空腹抽取 静脉血，分离血清后产即检测。1.2 检测试剂ELISA试剂盒由荣盛生物技术提供°TRFIA试剂盒由市丰华生物工程提供。1.3 仪器E

37、L-312e酶标仪。泰莱1时间分辨荧光分析仪°Egate231（全自动洗涤。2510 变频振荡器。1.4 质控物由卫生部临床检验中心提供。1.5 方法ELISA法和TRFIA法测定HBV-M严格按照试剂操作规程操作，同时加入相应 质控物监测。1.6 统计学方法采用配对X2检验。2结果2.1HBsAg ELISA法结果阳性36例,阳性率13.8%TRFIA法结果阳性40例,阳性率15.4% 两法都阳性36例，两法都阴性220例，TRFIA阳性而ELISA阴性4例，TRFIA阴性而ELISA 阳性无，采用配对X2检验,x2=4,Pv 0.05,差异有显著性，两法比较符合率为256/260

38、=98.46% 其中 HBsAg含量 0.55ng/ml 占 4例,6 25ng/ml 占 7 例,2650ng/ml 占 8例,5150ng/ml 占8例，150ng/ml以上占13例。2.2 抗-HBsELISA法结果阳性130例，阳性率50%TRFIA法结果阳性160例，阳性率61.5% 两法都阳性130例，两法都阴性100例，TRFIA阳性而ELISA阴性30例，TRFIA阴性而ELISA 阳性无，采用配对X2检验，x2=30,Pv0.01，差异有非常显著性，两法比较符合率为230/260=88.5% 其中-HBs含量 H00mlU/ml占 79 例，10200mlU/ml占 16 例

39、，201 1000mlU/m 占 46 例，1000mIU/m 以上占 19 例。2.3 HBeSg ELISA法结果阳性17例，阳性率6.5% TRFIA法结果阳性18例，阳性率6.9%两法都阳性17例，两法都阴性242例，TRFIA阳性而ELISA阴性1例，TRFIA阴性而 ELISA阳性无，采用配对X2检验，x2=1,P>0.05，差异无显著性，两法比较符合率为 259/260=99.6%其中 HBeS含量 0.030.1NCU/m占 1 例，0.11 0.5NCU/m占 4 例，0.51 2NCU/ml1 例，2.1 8NCU/ml1例。2.4 抗-HBeELISA法结果阳性86

40、例，阳性率33%TRFIA法结果阳性73例，阳性率28% 两法都阳性67例，两法都阴性168例，TRFIA阳性而ELISA阴性6例，TRFIA阴性而ELISA 阳性19例，采用配对x2检验，x2=6.76,Pv 0.01，差异有非常显著性，两法比较符合率为 235/260=90.4%其中抗-HBe含量 1.52NCU/ml1 例,2.1 5NCU/ml1例, 5.1 10NCU/ml23 例，20NCU/m以上24例。2.5抗-HBc ELISA法结果阳性54例，阳性率20.8% TRFIA法结果阳性72例，阳性率 27.7%两法都阳性52例，两法都阴性186例，TRFIA阳性而ELISA阴性

41、20例，TRFIA阴性 而ELISATO性2例，采用配对x2检验，x2=15.6,Pv 0.01，差异有非常显著性，两法比较符合 率为 238/260=91.5%其中抗-HBc含量 0.1 0.5NCU/ml11例, 0.51 1NCU/ml1例, 1 5NCU/ml1 例，5.1 10NCU/ml3例, 10NCU/m以上 14例。3讨论TRFIA法检测HBV-M与 ELISA法相比，其特异性和敏感性都高，特别是能够检测低浓度 HBsA和 HBeAg对减少HBV感染漏诊和误诊具有较高价值。因HBsA©日性是HBV感染的金标 准。有学者对血清呈低水平存在、血清HBsA约在5ng/ml

42、以下者做过研究，对象是非肝 炎患者住院人群，结果是占总人群的2.34%占HBsA©日性人群的23.16%而本文只检测出 1.5席口 10%此结果存在一定差异，有待进一步探讨。抗HBs是对HBV勺保护性免疫指标， 有学者认为仍有保护作用的最低抗HBs的浓度为10mlU/mJ提出基础免疫后高度抗体滴度的 再接种方案，最后一次接种后4周，如抗-HBs<10mIU/m立即再接种；10100mlU/ml 3 6个月后必须再接种口。实际工作中发现抗HBs定量检测对于监测、指导肝移值中乙型肝炎 免疫球蛋白的应用具有肯定作用。说明了对抗HBs定量的检测是很有必要的，同时也可了解 人体是否有抗-

43、HBs是否有足够的量可抵御HBV勺侵袭。本文抗-HBs结果显示，160例TRFIA 法阳性79例，抗-HBs浓度值在10100mlU/m以，此量因无确切的抵御能力，建议加强预 防措施。对于抗HBs阴性的人群更应做好预防，至于00mlU/m以上含量的人群，说明他们 已有好的抵御能力。另外结果提示,ELISA法的抗-HBe阳性率明显高于TRFIA法，由于本身 方法学的限制，最好在发出报告时加以综合分析或提高Cutoff值。从实验结果表明HBV-M各项阳性结果都显示了不同的含量，说明了人体感染HBV后, 病毒的复制程度或经抗病毒药物治疗后,HBV-M含量也随之变化，提示了动力学关系。据所 掌握的资料

44、观察，患都治疗前及治疗后HBV-M含量变化结果比较。见表 1。表1 2例病人HBV-I治疗前后结果比较 略可以看出，HBsA和HBeA逐渐下降，而所有抗体逐步增高，这说明抗病毒治疗是有效 的，同时也给临床预后判断提供了依据。目前临床上对检测HBV-M勺血清常用方法是血清免疫学检测，也就是检测患者对病毒 侵染机体产生的免疫反应，因此免疫血清学指标可间接反映病毒的感染状况。随着检测水平 的不断提高，TRFIA技术的问世给免疫自身的研究和发展提供了新的手段。虽網NA是直接 反映病毒本身在机体的存在情况，而人们越来越意识到两者既相关，又不尽一致，高灵敏准 确的HBV-定量结果可与HBV-DN的检测相互

45、印证，给临床提供更客观有效的实验报告，临 床上需要将两者结合起来对患者进行综合诊断治疗和预后等判断。如果在没有开展HBV-DNA项目检测的单位，HBV-M量检测其本身也就是一个很好监测病毒动力学变化的辅助指标。参考文献1、紫榕，病毒性肝炎，：人民卫生，2002 6, 191.2、瑜，钟步云，徐根云，等低水平血清乙肝病毒表面抗原测定及临床意义。中华检测医学杂志，2001, 24: 1.3、Klaus-peter Maier著，郝连杰等译第四版；人民卫生，1997, 8, 35。作者单位：521021省市中心医院检验科关于乙肝病毒标记物“两对半”定量测定和肝功能（肝纤维化）检测的通知各临床科室：为

46、增加我院临床诊断、治疗和观察病情的参考依据,进一步提高我院的医疗水平和我院 的综合竞争能力。我们要积极开展应用技术、新项目。最近检验科在院领导的大力支持下引 进了 WALLA公司生产的时间分辨荧光免疫分析系统该时间分辨荧光免疫分析系统可进行多 种检测（见附录）其中对“乙肝两对半”可进行准确的定量测定。欢迎各临床科选用医务科2002年 12月 25日一、两对半定量测定乙肝病毒（HBV标记物的检测方法常用测定乙肝病毒的抗原、抗体标记物，60年代末70 年代初的琼脂扩撒法，依次发展为血凝法T酶联免疫吸附ELISA、同位素免疫标记RIA T化学发光免疫分析、生物发光、电化学发光免疫标记和80年代中建立

47、的稀土离子荧光标记（时间分辨荧光免疫分析）等不同的检测方法。随着科学的发展和检验技术的进步，其方法 每发展一步，乙肝标记物检出的灵敏度和准确性都得到不同的提高（其中IA为I012mol/L、 ECL 10为 10'19 mol/L、CLIA为 10'15m ol/L、ECL1为-17/L、TRF为 1019 mol/L ）。其中时间分 辨荧光免疫分析（TRF为近年新研制成功的用三价稀土离子作为示踪物以单克降抗体包被 支持物与样品中抗原反应，再加入有铕EU标记的抗体，进行反应检测，可大大降低一般 同位素和荧光标记受环境干扰缺点，提高了检测的灵敏和准性，该RF法检测乙肝病毒标记 物

48、较其他方法灵敏度高、特异性好，因干扰因素少可优于以上各种方法，可与BV-DN的检 测相比（未经规化要求开展的HBV-DN检测，多年的临床实验证明，假阳性、假阴性率较高， 重复性差，且不能定量。TRF为目前检测乙肝病毒标记物最理想怕方法°TRF定量检测乙肝 病毒“两对半”为临床诊断乙肝提供了新手段，有助于临床客观的分析BV感染情况、疗效 的观察和转归等情况的分析，至少可对一列情况更具有独特的诊断价值：1、治疗前进行病毒定量检测，可以指导选择抗病毒药物，避免盲目用药。2、治疗后定量间接判断体病毒数量，有助于疗效的观察。3、怀孕前进行定量测定，有助于选择有利的怀孕时机。乙肝孕妇进行定量检查

49、，有助于使部分病人得到及进的正确的诊断二、两对半定量与定性组合测定今后检验科对乙肝“两对半”检查，可给临床提供两种选择，一种是乙肝病项定量 测定；另一种是定量与定性组合检查,即在乙肝“两对半”的五项检查中,HbsA（表面抗原）、 抗-HBs（表面抗体、HbeAg（E-R抗原）此3项重要的指标中必须有一项是定量的（其余4 项定性；也可选择其中2项做定量，其余3项做定性）。任上临床根据病人的经济情况选择， 但如果临床不注明，检验科一律做HbsAgt量与其余4定性检查。5项定量测定收费105元， 1项定量与其余4项定性检查收费45元。此举意义使“两对半”检查得到更加准确的结果与及更好解释和发挥“两对

50、半”检查 的临床意义；使临床检查“两对半”有更多、更切合患者利益选择，如病人经济许可，可 选择5项定量测定，如果经济困难即可注明选择其中项与其它4定性检查。此种组合合 理，检查意义大，符合国家循征医学的要求。（“两对半”定量检查，收费105元，如同时做生化全套，开检验单时请分开单，如“两 对半”为1项定量其余4项为定性检查在一检验单同时申请即可）医学院论著甲胎蛋白、癌胚抗原时间分辨荧光法与化学发光法比较王桂莲朱利国黄飚蔡刚明谭成金坚单位：省江原医院，241063关键词：时间分辨荧光免疫分析；化学发光免疫分析；甲胎蛋白；癌胚抗原3+摘要DTPA法制备了 Eu标单抗，采用夹心法建交了AFF和CEA

51、FMA它们的灵敏度分别为43ng/L和90ng/L；批CV为1.599吩口 1.36% 批间CV为7.1393和2.89%平均回收率为103.983和92.78%与CLIA进行临床应用比较显示结果高度相关(AFPr=0.9040,CEA r=0.9705)。中图分类号0657.9文献标识码A文章编号1000-2057(2000)02-0159-01甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA是迄今较为肯定的肿瘤标志物，忆广泛用于临床 肿瘤诊断，两者的检测已有RIA、EIA和IRMA等方法。近来发展的时间分辨荧光和化学 发光测量技术，信噪比较高，分析灵敏度超过了上述方法。我们在完成了AFP CEA 和I

52、RMA工作的基础上，采用时间分辨荧光测量技术，建交了时间分辨免疫荧光分析(Time-resolved Immunofluormetric assay,IFMA),并与化学发光免疫分析 (Chemiluminescence Immunoassay,CL)A进行比较。1材料与方法# #1.1试剂与设备抗CEA单抗G7和抗AFP单抗137和47由市第二制药厂提3+3+供。Eu标记盒(1244-302, Eu发光增强液(B118-110、AFF和CEA参考标准，EG &G-Wellac产品。二乙烯三胺五乙酸酐(DTP) Sigma产品。PD-10和Sepharose CL-6B,Pharmec

53、ia产品。CA-19-9 CA-12-5和 CA-15-3参考标准，AFP和 CEA CLIA 药盒，CIBA-CORNING品。牛IgG自制。去离子超纯水由本室采用Barnsteed公司超纯水器(D7033制备。96孔微扎板，Nunc产品。BSA生物制品的产品。其他试 剂均为国产分析纯。全自动IFMA检测仪(Auto DELFIA1235为EGkG-Wellac产品。 全自动CLIA检测仪(ACS180、为CIBACORNING产品。1.2方法3+1.2.1 CEA IFMA ( 1)固相 C7 和 Eu -C50制备：将 C7 单抗用50nm ol/L,3+NaCQNaHC33Ph9.6

54、释至10 mg/L。每孔加 200ul,4 C放置过夜。Eu -C50 制备参3+3+照Eu标记盒进行。每个C5olgG上连接了 13个Eu，产率达52.6% (2)测定方法：用含8mmol/LNaCI,0.1%BSA,0.2%牛 IgG, 50umol/LDTPA,0.1ml/LTween-80和 0.1%NaN 的 50mmol/L Tris-HCI ph7.8 为反应冲液，以含 14.5 水 mmol/L NaCI,0.2ml/L Twee n-8和0.2%Na3的上述缓冲液为洗涤液采用固相二步顺序夹心 法建立CEA-IFMA即在包被有G7的96孔微孔板上,每孔依次加入25ul CEA参

55、考标准或待测血清及200ul反应缓冲液,37 C振荡孵育2h后，用洗涤液洗4次。再加3200ul1:1000稀释的Eu+-C5o, 37C孵育1h,洗涤6次，加入增强液200ul,370170 反应5min,荧光检测。全部过程在Auto DELFIA123上自动完成。3+1.2.2 AFP IFMA (1)固相Ci7和Eu C137制备：方法同上，每个Ci3?IgG上连接3+一_了 7.52个Eu，产率达53.07% (2)测定方法：反应缓冲液和洗涤液同上。采用 固相二步顺序夹心法建交AFP-IFM, C47包被板每孔依次加入25ul AFP参考标准3+ 或待测血清及200ul反应缓冲液，37

56、C孵育1h后，加200ul: 1000稀释的Eu C50,孵育1h。后续方法同上。1.2.3 CEA和AFP CLIA参照药盒说明书，全部过程均在ACS18上自劝完成。2结果2.1CEAFMA以零剂量测量结果均值加上0.2S代入标准曲线分析,CEAIFMA的灵 敏度为90ng/L; AFP对本法无交叉反应，CA-19-9的交叉反应可达2.81%方法的批和批间CV分别为1.36%和 2.89%平均回收率为92.78%可测围为1.45 508.9ug/L。2.2 AFP IFMA以零剂量测量结果均值加上0.2S代入标准曲线分析,AFP IFMA勺灵 敏度为43ng/L; CEA CA-12-5 C

57、A-15-3和CA-19-9对方法无交叉反应；方法的 批和批间CV分别为1.599唏口 7.139%平均回收率为103.98%可测围为4.221210ul/L2.3 IFMA与CLIA同步比较137例正常人经CEAM和CLIA测量,结果高度相关 (r=0.9705)。148例正常人经AFP IFMA和 CLIA测量，结果相符(r=0.9040)。3讨论以往超微量免疫分析技术应用的普遍问题是稳定性难以满足于临床工作的需 要。鉴于放射性同位素示踪剂自身衰变或保存条件苛刻及自分解变性失活等原因 ，对于RIA和IRMA等方法，每次分析，即使单样品检测也必须做标准曲线相对 测量的依据oEIA本身方法学的

58、原因，不能完全定量。我们建立的AFF和CEAFMA 同批试剂连续5个月临床应用分析，标准曲线基本重合，无明显漂移。可以用同 批试剂单次标准曲线作为今后分析的固定参考曲线。CIBA-CORNlNGCLIA试剂盒 也同样可重复且稳定。就IFMA和CLIA经临床同步比较，结果相关性好。同时我 们也与我们自己的IRMA比较，结果也高度相关，说明上述两种方法可取代以往的 AFF和CEA分析方法。从方法学的考核情况看，多数指标与IRMA类同，但方法学 稳定性显著优于IRMA就IFMA与 CLIA临床比较方面，后者检测速度明显优于前 者，可作临床急诊诊断。而前者适合大批量的样品检测，稳定性更高，可测围更 宽，理论分