氨基糖苷类抗生素有关物质检查中的几个问题

1、氨基糖苷类抗生素有关物质检查中的几个问题审评三部冯杰张哲峰摘要：本文简要介绍了氨基糖苷类抗生素有关物质检查中杂质种类、检测方法比较以及限度确定等方面的几个问题，并例举了技术审评中遇到的几个问题，并对此进行了简要讨论。关键词：氨基糖苷类抗生素有关物质检测方法氨基糖苷类（aminoglycosides）抗生素是一类抗需氧革兰氏阴性杆菌,假单胞菌属,结核杆菌属和葡萄球菌的抗生素。此类抗生素的共同特点是由氨基环醇与氨基糖通过氧桥连接成苷类抗生素。氨基糖苷类抗生素都是无色、溶于水，含多羟基、多氨基的化合物。因含有氨基或其他碱性基团，故显碱性，可与无机酸和有机酸形成结晶性的盐，具有亲水性。该类抗生素分子量

2、较小，均在300-800之间。大部分是含水的无定形物，无特征性熔点，无紫外和红外的特征吸收峰。游离碱具有不同程度地吸收二氧化碳的能力。根据氨基糖苷类抗生素的抗菌特性及结构特点，此类抗生素可分为三个发展阶段。以卡那霉素为代表的第一代氨基糖苷类抗生素，其结构特点是完全羟基化的氨基糖与氨基环醇相结合，不抗绿脓杆菌；第二代以庆大霉素为代表，其结构中均含有脱氧氨基糖并具有抗绿脓杆菌的特点；第三代则是氨基环醇上氮位取代衍生物,品种有阿米卡星、阿司米星和我国创新的一类新药依替米星等，其特点是保留了母体的抗菌活性，耳肾毒性小，抗耐药性等。根据氨基糖数目分为假三糖类和假二糖类，氨基含量越多，抗菌能力越强。（见表

3、1）。表1 氨基糖苷类抗生素的分类产生菌化学第1 代第2 代第3 代链霉菌小单孢菌假三糖类:链霉素类假三糖类:新霉素类假三糖类:卡那霉素类假三糖类:庆大霉素类假三糖类: 西索米星类假二糖类:阿司米星类链霉素新霉素巴龙霉素核糖霉素卡那霉素妥布霉素地贝卡星庆大霉素小诺米星西索米星阿米卡星阿贝卡星异帕米星依替米星奈替米星阿司米星达地米星1、氨基糖苷类抗生素中的有关物质及其检测方法有关物质检查是本类抗生素质量控制的重要项目之一，同氨基糖苷类药物一样，其杂质最可能的毒副作用多为耳毒性，而这方面缺乏动物毒性试验模型，在药理毒理研究中难以发现，因此标准控制更为重要，各国药典均对其有关物质严加控制，表2、表3

4、、表4对比三个氨基糖苷类抗生素有关物质CP2005、BP2004、EP5、USP27、JP14的检验方法、限度要求和主要杂质及其结构。表2 各国药典对硫酸阿米卡星有关物质控制情况CP2005BP2004EP5USP27JP14 剂型原料药注射剂原料药原料药原料药注射剂原料药检查方法TLCHPLC法（柱后衍生）HPLC法（柱后衍生）无有关物质检查项TLC限度限度2.0杂质A不得过1.0%；单个杂质峰（除杂质A）不得过0.5%；杂质峰之和不得过1.5%杂质A不得过1.0%；单个杂质峰（除杂质A）不得过0.5%；杂质峰之和不得过1.5%限度1.0主要杂质 杂质A杂质A、B、C、D杂质A、B、C、D硫

5、酸阿米卡星的主要杂质结构杂质A： R1 = R3 = H, R2 = acyl，化学名称：4-O-(3-氨基-3-脱氧-a-D-葡吡喃糖基)-6-O-(6-氨基-6-脱氧-a-D-葡吡喃糖基)- 1-N-(2S)-4-氨基-2-羟基丁酰基-2-脱氧-L-链霉胺杂质B： R1 = R2 = acyl, R3 = H，化学名称：4-O-(3-氨基-3-脱氧-a-D-葡吡喃糖基)-6-O-(6-氨基-6-脱氧-a-D-葡吡喃糖基)-1,3-N-双(2S)-4-氨基-2-羟基丁酰基-2-2-脱氧-L-链霉胺杂质C： R1 = R2 = H, R3 = acyl R1 = R2 = H, R3 = ac

6、yl，化学名称：4-O-(6-氨基-6-脱氧-a-D-葡吡喃糖基)-6-O-3-(2S)-4-氨基-2-羟基丁酰基氨基-3-脱氧-a-D-葡吡喃糖基-2-脱氧-D-链霉胺杂质D： R1 = R2 = R3 = H: 卡那霉素. 表3 各国药典对硫酸西索米星有关物质控制情况CP2005BP2004EP5USP27JP14 剂型原料药注射剂未收载未收载原料药注射剂原料药检查方法无有关物质检查项无有关物质检查项 TLC限度限度6.0主要杂质 表4 各国药典对硫酸奈替米星有关物质控制情况CP2005BP2004EP5USP27JP14 剂型原料药注射剂（无有关物质检查项）原料药原料药原料药注射剂原料药

7、检查方法TLCHPLC（电化学检测器）HPLC法（柱后衍生）无有关物质检查项TLC限度最大不得过2.0%，其余不得过1.0% 杂质A不得过1.0%；杂质B不得过1.0%；单个杂质峰（除杂质A）不得过1.0%；杂质峰之和不得过2.0%杂质A不得过1.0%；单个杂质峰（除杂质A）不得过0.5%；杂质峰之和不得过1.5%限度6.0主要杂质 杂质A、B 、C、D杂质A、B、C、D硫酸奈替米星的主要杂质结构：杂质A： R1 = R2 = R3 = H。化学名称：2-脱氧-4-O-3-脱氧-4-C-甲基-3-(甲氨基)-b-L-阿拉伯糖吡喃糖基-6-O-(2,6-二氨基-2,3,4,6-四脱氧-a-D-甘

8、油基-4-烯己吡喃糖基)-L-链霉胺 杂质C：R1 = R3 = C2H5, R2 = H。化学名称：4-O-6-氨基-2,3,4,6-四脱氧-2-(乙氨基)-a-D-甘油基-4-烯己吡喃糖基-2-脱氧-6-O-3-脱氧-4-C-甲基-3-(甲氨基)-b-L-阿拉伯糖吡喃糖基-1-N-乙基-D-链霉胺(2¢-N-乙基奈替米星) 杂质D： R1 = H, R2 = R3 = C2H5。化学名称：4-O-2-氨基-2,3,4,6-四脱氧-6-(乙氨基)-a-D-甘油基-4-烯己吡喃糖基-2-脱氧-6-O-3-脱氧-4-C-甲基-3-(甲氨基)-b-L-阿拉伯糖吡喃糖基-1-N-乙基-D-

9、链霉胺(6¢-N-乙基奈替米星)杂质B： 2-脱氧-6-O-3-脱氧-4-C-甲基-3-(甲氨基)-b-L-阿拉伯糖吡喃糖基-1-N-乙基-D-链霉胺(1-N-乙基加纳糖胺). 2、技术审评中的几个问题（1）未建立有关物质检查或检查方法的分离效果、灵敏度欠佳。在审评中发现氨基糖苷类抗生素注射剂有关物质检查较多采用TLC法，中国药典2005年版收载的l2种氨基糖苷类抗生素中有8种采用薄层色谱鉴别方法。TLC法的灵敏度尚不能满足对注射剂质量控制的要求，并对杂质尚不能有效分离，尤其大容量注射液，主药浓度低，可能难以有效检出其中的杂质，有时氯化钠还会造成斑点拖尾，因此其可行性值得考虑。氨基糖

10、苷类抗生素无特征紫外吸收，不能直接采用传统HPLC(紫外)分析，也有用衍生化技术进行分析，但由于衍生化方法实验结果影响因素多，无法判断该法检测到的杂质来源，而且衍生方法操作繁锁，反应复杂，时间长都会影响测定结果的准确性。（2）在灭菌工艺条件筛选的评价指标中未列入有关物质检查或检查方法不能量化表达灭菌前后的有关物质变化情况。目前，对于部分氨基糖苷类抗生素的热稳定性尚不明确，评价指标中有关物质项有采用TLC法的，评价结论为未检出杂质或杂质斑点颜色未明显加深，加之TLC分离效能不足，且仅能考察单个杂质而不能控制杂质总量，特别是对含量较小的杂质无法检出，对于灭菌前后杂质的种类变化情况和杂质的量的变化不

11、能准确表达，造成对灭菌工艺可行性评价缺乏客观、准确的数据支持，为药品安全性埋下了隐患。（3）对已知杂质研究不全面。在采用HPLC法（柱后衍生）或HPLC-ELSD法进行有关物质方法学研究时，对于已知的杂质未进行杂质种类研究，现BP等已明确了部分氨基糖苷类抗生素的杂质结构和色谱行为，申报资料中大多未进行对比研究，造成药品质量内在信息不能清晰、明确显示。3、几点建议（1）鉴于氨基糖甙类抗生素无特征紫外吸收，建议申请人采用HPLC-ELSD法。已有文献报道该方法测定硫酸阿米卡星及其有关物质，ELSD检测器为质量型检测器，它不依赖于样品的光学特征，能准确检测到不含发色团的化合物，ELSD的响应值与质量成正比，因此能用于测定硫酸阿米卡星的含量及有关物质。研究中需进行检测方法的验证，专属性验证除进行强制降