感受态细胞制备及各种感受态的特点

1、感受态细胞制备制备感受态常用的方法是电击法和CaC2制备法，以下介绍 CaC2制备法：1、 可以从-80 C冰柜中，取出一支冻存菌株， 于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环 轻轻蘸取菌种后， 在无抗平板 （由于 Rocetta 含有氯霉素抗性， 需要涂布在氯霉素抗性的平 板，后面的都是如此）上划线，并将菌种迅速放回 -80 C保存，在划线板上做好相应标记，于37 C培养过夜。2、从37 C培养过夜的新鲜平板上挑取一个单克隆，接种于 2mlEP管中，37 C, 220rpm 震荡培养约 6个小时至对数生长中后期；将该菌悬液以 1:100 的比例接种于 50ml LB 液体 培养基（ 2瓶）中

2、，37 C振荡培养2.5小时至OD600=0.5 。注意：接种比例不得大于 1:10。3、 在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管 （50ml ）中,在冰上放置 510min ； 注意：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管,划板、接种、转接 均要严格按照无菌操作。4、 4C 5000g 离心 5 分钟。用预冷的去离子水洗涤沉淀,4C 5000g 离心 5 分钟；Note ：此步主要是为了洗去培养基中的盐等5 、沉淀加入 2ml 预冷的 0.05mol/L CaCl 2-1 5%甘油混合溶液, 轻吹散,冰浴5分钟, 4C5000g 离心 5 分钟；6、沉淀加入 2ml

3、 预冷的 0.05mol/L CaCl 2-15%甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞悬液。分装成50100卩l的小份，贮存于-70 C可保存半年。含 15%甘油的 0.05mol/L CaCl 2制备方法 :称取0.28g CaCl2（无水,分析纯），溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml,高压灭 菌。感受态细胞的特征 感受态：通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源 DNA 的状态。感受态细胞的特征： （1 ）细胞表面暴露出一些可接受外来DNA 的位点（以溶菌酶处理,可促使受体细胞的接受位点充分暴露） 。（2）细胞膜通透性增加（用钙离子处理,可使膜通透性增加,使DNA直接穿过

4、质膜进入细胞） 。 （ 3 ）受体细胞的修饰酶活性最高,而限制酶活性最低,使转入的 DNA 分子不易被切除或破坏。实验室常用的感受态细胞1. DH5 a菌株克隆菌株：DH5 a是一种常用于质粒克隆和高拷贝质粒的稳定复制的菌株。E.COli DH5 a在使用pUC系列质粒载体转化时，其$ 80lacZ M15基因产物可与载体编码的半乳糖苷酶氨基端实现 a互补，可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。Rec A1和end A1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒 DNA的提取。基因型：F-、$ 80dlacZ M15 (lacZYA-argF)U169、deoR、recAI、endA1、hsdR17(r

5、k -, mk+)、phoA、supE44、X、thi-1、gyrA96、relA12. TOP10 菌株克隆菌株：该菌株适用于高效的 DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。基因型：F-、mcrAA (mrr -hsd RMS-mcrBC)、$ 80、lacZ M15、 lac X 74、 recA1、ara A 139 A (araleu)7697、 galU、galK、rps、(Strr) endA1、 nupG3. BL21(DE3) 菌株：蛋白表达菌株：该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。该菌株用于 T7 RNA聚合酶为表达系统的高

6、效外源基因的蛋白表达宿主，T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于 入噬菌体DE3区的acUV5启动子，该区整合于 BL21的 染色体上。该菌株适合于非毒性蛋白的表达。基因型：F-、ompT、 hsdS (B-mB-)、gal、dcm ( DE3 )4. BL21(DE3) pLysS 菌株蛋白表达菌株：该菌株含有质粒 pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶 的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。 该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。基因型：F-、ompT、hsdS (B-m b-)、gal、 dcm ( DE3 )、pLysS、Camr5. Roc

7、etta感受态特征:蛋白表达菌株Rosetta系列菌株来源于 BL21系列宿主菌，该系列菌株含有原本在大肠杆菌中稀少的真核细胞密码子，增加了真核细胞的蛋白表达水平。(1) Rocetta ( DE3)该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子(AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA )对应的tRNA，这样Rocetta菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制，提高外源基因尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。tRNA基因由它们的天然启动子驱动。基因型：F-、ompT、hsdSB (r B - mB - )、gal、dcm、lacY

8、1(DE3)、pRARE(argU ， argW， ileX， glyT， leuW， proL)(Cmr )补充：稀有密码子对蛋白表达的影响： 数氨基酸都有一个以上的密码子， 对E.coli密码子应用情况分析表明一些密码子很少使用 ， 尤其是精氨酸密码子 AGA , AGG , CGG , CGA;异亮氨酸的密码子 AUA；亮氨酸的密码子 CUA和甘氨酸的密码子 GGA和脯氨酸 的密码子CCC很少被用到。目的基因中含有过多的稀有密码子被认为是低表达水平和产生不完全产物的一个原因。当在氨基端附近出现多个稀有密码子的时候，情况更为严重，许多研究表明，精氨酸的密码子AGA和AGG的高频出现可能大大

9、影响蛋白的产量。当这些密码子出现在 N-端附近时候，这种影响将达到最大。多个实验室报道，在宿主菌中增加同类 tRNA时那些含有稀有密码子基因的蛋白产量将大大提高。 RosettaTM菌株可以增 加精氨酸稀有密码子 AGG和AGA,异亮氨酸的密码子AUA；亮氨酸的密码子CUA和甘氨酸的密码子GGA和脯氨酸的密码子 CCG 因此，很适合用于表达那些含 E.coli稀有密码子基因的目的蛋白.(引用自网址)(2) Rosetta 2 (DE3) pLySs 来源于 Rosetta(DE3)，本菌株含有 pRARE2 质粒，除了能够 提供原Rosetta(DE3)宿主菌含有 AUA, AGG, AGA,

10、 CUA, CCC, 和GGA六个稀有密码子的 tRNA夕卜，还提供了第七个稀有密码子CGG的tRNA。同时，pRARE2质粒具有氯霉素抗性。Rosetta2(DE3)pLySs 载体通过提供稀有密码子，使得该宿主菌相对于其他大肠杆菌， 能够提供更加 通用”的蛋白质表达，从而提升目的蛋白表达水平。DE3是溶源性的 入DE3,所 以带有T7 RNA聚合酶的染色体拷贝。该菌株适用于pET系列载体，及其他 T7启动子系列载体。含有pLSs质粒，pLySs质粒能够产生T7溶菌酶，可以有效降低目的基因的基础 表达水平。pLySs质粒使得该菌株具有氯霉素抗性。pLySs质粒的起始复制位点是 p15 Ori

11、gin, 这使得该质粒能够和 pUC-及pBR322-衍生的质粒互相共存。转化1、 转化的原理：溶液中的 Ca离子和细菌细胞膜结合，在低温下形成液晶结构，在42 C,90s热激下，这种液晶结构收缩，将细胞膜扯开孔道，使DNA进入细菌细胞中。2、转化的步骤：（1）取感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化的细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，置于冰浴中。（2）向感受态细胞中加入目的DNA（50ul感受态细胞能够被1ng超螺旋DNA所饱和），轻弹混匀，在冰浴中静置 30min ;注意：一次转化感受态细胞的建议用量为 50ul，可以根据实际情况分装使用， 应注意所用DNA体积不能超过感受态细胞悬液体

12、积的十分之一，也有说法是不能超过 5%。不能加入太多DNA，会影响转化效率，体积不能超过 10ul，所以连接时做10ul连接 体系可用一半做转化，剩下的放在 4 Co（3） 将离心管置于42度水浴中放置90s，然后快速转移到冰浴中， 使细胞冷却2-3min （ 般2min ），该过程不要摇动离心管；（4）向每个离心管中加入 500ul无菌的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37度摇床震荡培养45min （150rpm ），目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。（5） 将离心管内容物混匀，可吸取适量（可吸取200-300，也可据情况而定）转化产物涂布平板，而如果预计的克隆较少，可通过离心（4000rpm， 2min ）后，吸掉部分上清，悬浮菌体后将其涂布