辅助噬菌体在噬菌体展示技术中的应用

1、微生物学通报MicrobiologytongbaoFEB 20, 2009, 36(2): 2612662009 by Institute of Microbiology, CAS辅助噬菌体在噬菌体展示中的应用及研究进展杜东霞张冉(湖南师范大学医学院微生物学教研室湖南长沙 410081)摘 要：噬菌体展示技术是一种将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白相融合，展示于噬菌体 表面来构建蛋白质或多肽文库，并从中筛选目的蛋白、多肽或抗体的基因工程高新技术。噬菌粒/辅助噬菌体系统是最常用的噬菌体展示系统，此系统中辅助噬菌体对噬菌粒的复制和组装发挥着 至关重要的作用。本文结合当今该领域的最新研究动态，概述

2、了噬菌粒和辅助噬菌体双基因组系 统，着重介绍了不同辅助噬菌体的特点及其突变机制，并对其应用前景进行了展望，以期为该技 术的进一步完善提供一定的借鉴作用。关键词：噬菌体展示，辅助噬菌体，噬菌粒，超感染Applicati on and Progress of Helper Phage in Phage DisplayDU Don g-Xia ZHANG Ran(Department of Microbiology, College of Medicine, Hunan Normal University, Changsha , Hunan 410081, China)Abstract: Phage

3、 display is a widely used gene engin eeri ng high tech no logy. Through the display of exogenous peptides or prote ins fused specific coat prote in on the surface of phages, it is possible to con struct proteins or peptides libraries and screen interesting proteins, peptides and antibodies successfu

4、lly. Most commonly used phage display tech no logy is phagemid/helper phage system, in which helper phages are esse ntial for the replicati on and assembly of phagemid particles. In this review, in comb in ati on with the n ewest research dyn amic status, we summarize phagemid/helper phage double-ge

5、 nome system. We main ly emphasized the features and mutati on mecha ni sms of differe nt helper phages. We also made some prospects for the future directi on s, in the mea nwhile, we also expect that our experie nce can provide some help for further maturity of the tech no logy.Keywords: Phage disp

6、lay, Helper phage, Phagemid, Superinfecting基金项目：湖南省自然科学基金资助项目(No. 05JJ30065)通讯作者：Tel: 86-731-8912422; 匕：zhangran008收稿日期：2008-06-24;接受日期：2008-09-11近年来，在肿瘤学、免疫学、蛋白质工程和配体、受体等研究领域中，噬菌体展示技术(PhageDisplay Techniques, PDT)逐渐发展成为这些领域的 主流技术。该技术的最大特点是将基因型和表现 型直接偶联，确保能够方便、快速地获得所展示的 目的蛋白和编码此蛋白的基因。通常用于噬菌体展示的载体有两类

7、：即噬菌体 载体和噬菌粒(phagemid)载体2。由于噬菌粒载体具杜东霞等：辅助噬菌体在噬菌体展示中的应用及研究进展265有基因组较小、易于操作、可插入的片段较大、转 化效率高、产生的重组体更加稳定等优点，目前最常用的就是噬菌粒载体。噬菌粒只含噬菌体的部分 遗传信息，因而建库与筛库都需要辅助噬菌体 (helper phage)为宿主细胞的噬菌粒DNA提供复制和包装所需的蛋白酶和外壳蛋白3。辅助噬菌体提供的复制和包装机制，不仅对噬 菌粒基因组起作用，而且对辅助噬菌体自身的基因 组也起作用。筛选时那些含有辅助噬菌体基因组的 重组噬菌体可能会非特异性结合到选择靶分子上,严重降低筛选效率4,因此辅助

8、噬菌体对噬菌粒文 库的质量是非常重要的。通过对辅助噬菌体的不断 改进，不仅可以有效地提高目的蛋白展示水平，而且可使从噬菌粒文库中筛选特异性结合子变得更加 容易可靠，从而使噬菌体展示技术作为一种高通量 的筛选技术也正变得日臻成熟和完善。1噬菌粒和辅助噬菌体的双基因组系统噬菌粒实际上是带有丝状噬菌体大间隔区(in trage nic regio n, IG),集质粒和丝状噬菌体有利特征于一身的载体，具有ColE1复制起点及抗生素抗 性选择标记、以及丝状噬菌体的间隔区。研究时，可 以将外源基因以双链的形式定向整合至噬菌粒，再将其转化至宿主菌。虽然噬菌粒载体携带有 M13噬 菌体的IG区，能够合成单链

9、 DNA(ssDNA),但是它 没有M13噬菌体的功能基因，没有M13噬菌体的 gII产物存在，所以不能独立合成ssDNA。在宿主菌 中，若没有辅助噬菌体超感染，噬菌粒就像质粒一样进行基因扩增；若有，则辅助噬菌体的gII产物将 启动噬菌粒的滚环复制，产生噬菌粒的单链拷贝,这些单链拷贝经切割后产生切口、环化，最后被装进完整的子代噬菌体颗粒中1,5。辅助噬菌体是一类自身DNA复制效率极低的丝状噬菌体的突变型，其基因组DNA具有M13噬 菌体的所有功能基因，但是IG区是缺陷的，因而其 pII蛋白对这个序列不能有效识别，辅助噬菌体本身 的DNA也就不能进行单链复制，于是能够为噬菌 粒提供pII蛋白和包

10、装蛋白。辅助噬菌体的IG区的失活，同时使得其本身的基因不能表达。为使辅助 噬菌体的所有功能基因都能表达，必须在辅助噬菌 体的基因组中导入新的复制起点，一般间隔区中插 入的是lac Z序列。当含有重组基因的噬菌粒转染至大肠杆菌后，再用辅助噬菌体进行超感染，辅助噬菌体合成的pII蛋白就会优先识别噬菌粒上的正常 基因间隔区，启动滚环复制，产生ssDNA,这样所 产生的子代噬菌体外壳蛋白所包装的ssDNA主要是来自含有重组基因的噬菌粒的DNA,并同时展示噬菌粒编码的pIII或pVIII与外源肽段的融合蛋白 和辅助噬菌体编码的野生型的pIII或pVIII蛋白，确保重组噬菌体能正常感染、组装和增殖5-7。

11、2辅助噬菌体的突变机制及特点通过不同的机制构建的辅助噬菌体主要有两大 类，即含全长gIII的辅助噬菌体、gIII删除或gIII 缺陷的辅助噬菌体。2.1 含全长gIII的辅助噬菌体含全长gIII的辅助噬菌体主要包括 M13KO7、 R408和VCSM13,它们是最广泛使用的辅助噬菌体 通常称之为标准的辅助噬菌体。辅助噬菌体M13KO7是M13噬菌体的一个突 变体，带有一个质粒复制起点、卡那霉素抗性基因 以及G6125T的突变基因II。当M13KO7超感染含 有噬菌粒的菌株时，M13KO7突变的gII产物将优先 作用于噬菌粒载体上的复制起始区，使得噬菌粒产 生的(+)链多于辅助噬菌体产生的(+)

12、链，因而保证了感染细胞产生的病毒颗粒中来源于噬菌粒的单链 DNA占优势。当M13KO7生长在没有噬菌粒载体 的条件下时，突变gII的产物又能与其被损坏的复 制起始区作用，产生足量的噬菌体，用于超感染。 Vieira J等用辅助噬菌体M13KO7超感染含有噬菌 粒pUC的菌株MV1184和MV1190时，结果包装单 链质粒 DNA 的噬菌体滴度即达1011CFU/mL5X 101 CFU/mL。VCSM13 (Stratage ne, La Jolla, CA, USA) 是 M13KO7的一个突变体。R4089是由Russe M等构建的，是f1噬菌体的 一个突变体,删除了其IG中的24 bp的

13、区段，从而 使其包装带有完整信号的单链DNA优于其自身单链DNA。另外，它还带有一个称为IRI的突变，使 得它对缺陷病毒的干扰不敏感。与M13KO7不同的是,R408不带抗生素抗性标记基因。用辅助噬菌体 R408超感染含有 pEMBL19的菌株 HB101,结果大 大提高了单链质粒 DNA的产量。这些含全长gIII基因的辅助噬菌体进行超感染的优点是：产生的辅助噬菌体和重组噬菌粒颗粒的 滴度均较高；单价展示所产生的目的蛋白的特异性 强。其缺点是：虽然这些辅助噬菌体基因组不具有 包装信号，但是超感染后所产生的辅助噬菌体的数 目有时与噬菌粒颗粒的数目相同，有时甚至超过噬菌粒颗粒的数目，这种表现型和基

14、因型的不一致严 重降低了筛选效率；而且由噬菌粒编码的融合蛋白 同辅助噬菌体编码的野生型pIII相比，在噬菌体组装时噬菌粒编码的融合蛋白嵌入噬菌体的效率低：因此展示水平较低,仅为单价展示（图1A）。展示水 平和筛选效率的降低，很有可能共同导致分离特异 性结合子阳性克隆的失败3,10,11。2.2完全删除gIII的辅助噬菌体辅助噬菌体 M13MDD3.2、R408d3、VCSM13d3 是通过分别删除辅助噬菌体M13KO7、R408和 VCSM13的gill而构建的。Marta Duefias 等将 M13KO7 的 glll（1579-2851） 删除但保留完整的IG,用携带glll的辅助质粒提

15、供 plll蛋白,构建了辅助噬菌体 M13MDA3.2 12,并将 MI3MDA3.2 和 fKN16、fCA55 及 MI3MDA3 四种辅 助噬菌体在感染力和对重组噬菌体扩增和选择能力 上进行了比较。结果，MI3MDA3.2无论是感染力还 是对重组噬菌体的扩增和选择能力都是最强的。Rakonjac J等通过分别删除 R408和VCSM13 的glll,用携带有glll的辅助质粒pJARA 110提供 plll蛋白而构建了辅助噬菌体R408d3和 VCSM13d313。用 R408d3 和 VCSM13d3 感染含有 噬菌粒pComb3的菌株XL1-Blue,检测它们包装噬 菌粒的能力。结果

16、他们都能高效率的包装噬菌粒：但R408d3包装辅助质粒的水平比 VCSM13d3低得 多，有数据显示用 R408d3援救所产生的重组噬菌 体的感染背景比VCSM13d3低1800倍。在这些删除glll基因的辅助噬菌体援救系统中： 将此辅助噬菌体的基因组导入通过辅助质粒提供 plll蛋白的大肠杆菌细胞内，并通过由此产生的具 有感染性的辅助噬菌体用来援救重组的噬菌粒载体：这就使得噬菌体组装时 plll的唯一来源仅是由噬菌 粒编码的融合蛋白，由于丝状噬菌体的 plll蛋白有 35个拷贝，这种多价展示在一定程度上提高了重 组噬菌体的展示水平（图1B）,但所展示目的蛋白的 平均亲和力降低了 ，当要求得到

17、高亲和力的目的蛋 白时，glll删除的辅助噬菌体的使用就受到了限制14。而且，尽管辅助质粒不含有包装信号，但其基因组也被低水平包装，这在一定程度上造成了污 染。另外，glll的缺失或许会对噬菌体的其他基因产 生极性效应，造成glll缺陷的辅助噬菌体产量非常 低，这也严重限制了删除glll的辅助噬菌体的使2,3,15用。2.3 glll缺陷的辅助噬菌体2.3.1部分删除glll的辅助噬菌体：最近，Ron dot S 等人对glll删除的辅助噬菌体又进行了进一步创造 性的改进，从辅助噬菌体M13KO7基因组中删除glll的开放阅读框（ORF）,仅留启动子和信号肽，并 在信号肽后加一个短肽，同时构建

18、大肠杆菌细胞包 装系（DH5 o/plll）来提供plll蛋白的，构建了新的辅 助噬菌体hyperphage16。这同完全删除glll的辅助 噬菌体相比，避免了极性效应导致的噬菌体产量的 降低，从而使得hyperphage的滴度大大提高，但仍 略低于辅助噬菌体 M13KO7的滴度。同时还避免 了通过辅助质粒来提供plll在噬菌体进行包装时所造成的污染。Ron dot S等分别用辅助噬菌体 hyperphage和 M13KO7 超感染携带有噬菌粒 pSEX81-phox的菌株Top10F'时，通过感染力和抗原 的结合能力实验来检测重组噬菌体颗粒的装配及其 功能，结果二者在重组噬菌体的装配

19、及其感染力方 面没有什么不同。接着又对来自pSEX/M13KO7和pSEX/hyperphage系统的相同滴度的重组噬菌体 进行了免疫印迹分析，结果后者展示scFv- plll融合 蛋白的量是较多的。在用破伤风毒素筛选由 hypercharge包装产生的人类scFv库时，特异性的结 合子有了明显的增加。经两轮筛选后，50%以上的噬菌体都结合到抗原上，而用普通的 M13KO7仅有 3 %勺噬菌体结合到抗原上。R Arjen Kramer等通过删除VCSM13基因组上 glll的具感染力的 N1和N2区而保留CT区，用辅 助质粒pUC19-gIII提供plll蛋白而成功构建了 CT 辅助噬菌体17

20、。由于CT辅助噬菌体编码的是一个 截短的plll蛋白，缺乏负责感染的N1和N2结构域, 因此用CT辅助噬菌体援救的重组噬菌体必须是嵌 入了融合蛋白（外源蛋白与plll蛋白的融合）,才具 有感染性。同时由于plll的CT结构域可以稳定噬菌体的完整性和促进噬菌体的释放 ,并且CT结构 域和VCSM13的全长glll编码量相当，因而CT辅 助噬菌体的装配就少于依赖辅助质粒编码的 plll蛋BNogmc 3|=1Displayed proleinFuM length g3pPhagcmid genomeHelper phage genome图1不同辅助噬菌体援救的重组噬菌体的特征Fig. 1The f

21、eatures of recombinate phage of different helper phage rescue白，这就提高了噬菌粒颗粒的有效包装（图1C）。用CT辅助噬菌体和 VCSM13辅助噬菌体分别援救 scFv 库（pHEN-TG1、pHENCD8、pHEN-BG 和 pHEN-BT）,结果两者对scFv都显示出较高的展示 水平，经过两轮筛选后也都筛选到大量的阳性克隆 子，二者相比，CT辅助噬菌体能使感染背景降低至 少 100000 倍。2.3.2条件性删除gIII的辅助噬菌体：辅助噬菌体 Ex-phage、Phaberge Ex12 和 VCSM13N1 都在其 gill中

22、引入了琥珀终止密码子（UAG）。在抑制性菌株 （suppressor strains）中，琥珀终止密码子可以发生通 读，能够有效的编码 pill，从而产生具感染性的辅 助噬菌体；在非抑制性菌株（non-suppressor strains）， 琥珀终止密码子不能发生通读，使得辅助噬菌体自 身不能编码 pill，在重组噬菌体组装时，噬菌粒编 码的目的蛋白与plll的融合蛋白成为plll的唯一来 源（图1D）。因而这类辅助噬菌体使用起来比其他的 glll缺陷的辅助噬菌体更加简单，其产量和展示水平也更高2,18。Soltes G等用琥珀终止密码子替代辅助噬菌体 M13KO7基因组中glll的3端密码

23、子 Q350并且诱 导密码子S351发生沉默突变，成功构建了辅助噬菌 体 Phaberg9,同时构建了噬菌粒pMAB66、 pMAB77 和 pMAB87,其中 pMAB66 和 pMAB77 整 合了抗破伤风毒素的人全长Fab片段（VHCw+VkCk）基因，而pMAB87未整合此基因，并且glll被提前 终止。Glenn Soltes等用辅助噬菌体Phaberge和M13KO7分别超感染含有噬菌粒pMAB66、pMAB77和pMAB87的非抑制性菌株 TOP10F'。结果二者援 救的重组噬菌体的滴度相当，但与M13KO7相比, Phaberge可使Fab片段的展示水平提高 5-20倍

24、。而 且Phaberge仅仅包装含目的基因的噬菌粒pMAB66和pMAB77,不包装未整合目的基因的噬菌粒如 pMAB87,从而保证了噬菌粒文库的质量。Baek H等人用密码子 UAG替代辅助噬菌体 M13KO7基因组中glll 5端的第一和第三个密码子 GAA,成功构建了辅助噬菌体Ex-phage20,同时也构建了噬菌粒 plGT3,并使它只有在非抑制性菌株 中才表达抗体和 plll的融合蛋白。用 Ex-phage和 M13KO7超感染含有噬菌粒 plGT3的非抑制性菌株 JS5,检测了他们包装产生的重组噬菌体的滴度、 scFv-plll的展示水平、结合抗原的敏感性以及两轮 筛选后富集能力。

25、结果除了在包装产生的重组噬菌 体的滴度方面Ex-phage要低于M13KO7之外，在其 他方面Ex-phage显示出了极大的优势。在非抑制性 菌株中，由于辅助噬菌体Ex-phage的琥珀终止密码 不能有效通读，因而不能表达 plll,这就使得噬菌 粒plGT3编码的抗体-plll的融合蛋白是plll的唯一 来源。2006年Mi-young Oh 等用密码子UAG替代辅 助噬菌体M13KO7基因组中glll 5'端的第一和第二 个密码子GAA成功构建了辅助噬菌体 Ex1221。同 M13KO7相比，辅助噬菌体Ex12在抑制性菌株中能 产生10%勺野生型 plll。将二者分别超感染含有噬

26、菌粒pCMTG-SP112Fab（抗丙酮酸脱氢酶Fab抗体片 段）的抑制性菌株 XL-1 Blue MRF '。结果表明，与M13KO7相比,Ex12的展示水平提高了 50倍,对抗 原的结合能力提高了100倍并且大大提高了特异性抗原的淘选效率。高荣凯和王琰等采用重叠延伸 PCR技术对辅助 噬菌体VCSM13的gIII N1区的Q位点进行琥珀突 变构建了辅助噬菌体 VCSM13NI 22。在抑制性菌株 XL1-Blue中其滴度达到2.5 x lOcFU/mL,与野生型 VCSM13相似（4 x 10 CFU/mL）,而在非抑制性菌株 HB2151中，其滴度降低了数万倍。 因而用辅助噬菌

27、体VCSM13NI在抑制性菌中制备 HBsAg噬菌体抗 体，可以得到与野生型相似的结果。2.3.3 gIII中插入胰蛋白酶位点的辅助噬菌体：Kristensen P和Winte G将编码蛋白酶切位点的序列 插入噬菌体载体fd-DOG的N端（N1-N2区）和CT区 构建了噬菌体载体fd-K108,将辅助噬菌体 VCSM13的BamH I -Clal片段插入噬菌体载体 fd-K108中,即得到辅助噬菌体 KM1323。由于pIII 的N-端区域是噬菌体感染所必需的，因此在N端（N1 - N2区）和CT区插入蛋白酶裂解位点，在筛选 时用胰蛋白酶处理就使得辅助噬菌体KM13的pIII失去了感染力（图1

28、E）。尽管使用辅助噬菌体KM13没有改变展示效率，但是通过破坏辅助噬菌体pIII的感染力的调节，可以使得仅仅展示有pill融合蛋白的噬菌体才具有感染力，因此有效地降低了感染 背景，提高了筛选效率。3问题与展望现已证明通过对辅助噬菌体的改进不但提高了 展示水平，而且有效地降低了感染背景，特别是 gill缺陷的辅助噬菌体的构建不仅提高了展示水平,而且为实现选择感染性噬菌体技术（SIP）24提供了一个有效手段，从而使得从噬菌粒文库中筛选特异 性的结合子变得更加容易、有效。尽管这些系统已经克服了辅助噬菌体的一些缺点，但不能避免使用辅助噬菌体的主要问题，即将辅助噬菌体加至细菌生长培养基上，就相对限制了

29、细菌的生长周期。Chasteen L发展了不使用辅助噬 菌体的噬菌体展示技术，但需要构建辅助质粒，并 建立含有辅助质粒的细菌包装细胞系25。噬菌体展示技术本身还有许多可改进的空间,随着该技术的发展与完善 ，人们可以根据需要，在 更大程度上改造和制备各种生物分子 ，从而更好地开发噬菌体展示技术的应用潜力26。可以预见，噬菌体展示技术作为一项极为高效的表达、筛选体系,将会在蛋白质组学研究、生物制药、疾病的预防诊 断治疗等各领域成为一种更为有效的方法。参考文献1 Pini A, Bracci L. Phage display of antibody fragments.Current Protein

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40、会主办的创新为主的综合性学术期刊。刊登内容包括：微生物学、生物工程、病毒学、酶工程、发酵工程、细胞工程等领域的最新研究成果，产业化新技术和新进展。设置的栏目有：研究报告、专论与综述、生物实验室校教学、名师讲堂、教学与科研成果展示、显微世界、专题专栏、专家论坛、书讯、会讯等。2投稿方式投稿时请登陆我刊主页点击作者投稿区，第一次投稿请先注册码，然后依照提示提交稿件，详见主页“投稿、征稿须知”。作者必须在网站投.doc格式的电子稿，图与文字编好页码、图号后合成一个文件上传。凡不符合 文稿，本部恕不受理。3 写作要求来稿要求论点明确，数据可靠，简明通顺，重点突出。3.1 篇幅以A4纸5号字计算，综述、教学和方法类文章最好在 e18.21 Mi-young Oh, Hyun-yoo Joo, Byung-ung Hur. Enhancing phage display of antibody fragments using gill-amber suppression. Gene, 2007, 386: 81 - 89.22 高荣凯，王 琰.琥珀突变型辅助病毒VCSM13N1 的构建.第