血浆EBVDNA水平的动力学监测在鼻咽癌放疗过程中的意义

1、血浆EBVDN脉平的动力学监测在鼻咽癌放疗过程中的意义随着放疗设备和技术的改进、综合治疗的广泛应用,鼻咽癌的疗效有了明显提高,但仍有约30%40%治疗后完全缓解的患者因复发或转移导致治疗失败。国内外学者研究发现血浆EB病毒(EBV)DNRK平在鼻咽癌的早期诊断、预后判断及监测治疗后转移、复发中具有重要意义1,2。本实验对鼻咽癌放疗期间血浆EBVDNAK平的动力学进行研究,明确放疗过程中患者外周血EBVDNAK平的动态变化规律与临床疗效的关系,为临床采用外周血进行治疗后监测提供参考。1 材料和方法1.1 临床资料2005年6月至2007年12月在我科住院治疗的鼻咽癌患者按以下纳入标准选择入组:病

2、理为鼻咽低分化鳞癌;初治患者；无远处转移；治疗前血浆EBVDNA?阳性。共收集44例病例，其中男34例，女10例，中位年龄50岁，田期患者30例(68.18%),IV期患者14例(31.82)。治疗前均接受鼻咽、颈部CT扫描、电子鼻咽镜检、胸片、腹部B超及相关实验室检查以明确分期及除外远处转移。所有患者均接受体外根治性放疗,鼻咽部剂量7076Gy,颈部剂量6670Gy,颈部预防量50Gy。1.2 标本收集所有患者在治疗期间每周的第1天采血1次,第1次采血时间为治疗前1周内,最后1次放疗前为放疗结束时。整个治疗过程中共采血8次，每次抽取外周血2ml,加入EDT附凝管,离心后吸取血浆于-20冻存待

3、测。共收集血样352份。1.3 检测方法运用荧光定量PC砒检测患者血浆EBVDN豕平。使用中山大学达安基因XX公司提供的EBV核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒,操作严格按说明书进行。扩增的目的基因来自EBVEBAN-1片段(10?9151-10?9435),片段长284bp。上、下游引物分别为:5-GTAGAAGGCCATTTTCC3、AC-5'-TTTC-TACGTGACTCCTAGCC-3在PC版应体系中力口入一个双末端标记的荧光探针,探针序列为5'-(FAM)ACCACCCGTGGCCCAGATGG(TAMRA每批PCR反应设置阴性对照，强阳性对照(1.0X10?62.0

4、X10?7copies/ml),临界阳性对照(2.0X10?22.0x10?4copies/ml),阳性标准品稀释成不同浓度梯度10?6、10?5、10?4、10?3、10?2copies/ml),进行PCRT增。PCR&应总体积50",含有10"的5buffer,引物、探针各0.5NdNTP共0.5”,Taq酶1l,DNA模板5以l,吸取抽提的DNA5”入PC版应管中,在GE-5700实时荧光定量PCR仪中进行扩增反应，反应条件为93C2min,1循环;93C,45sf55C,60s,10循环;93C,30sf55C,45s,30循环。反应结束后,用计算机将样本和

5、标准曲线对比,计算出反应体系中待测标本中的DNA拷贝数。1.4 临床疗效观察治疗期间每周临床检查患者鼻咽肿瘤消退情况,在放疗完成40Gy和70Gy时行鼻咽CT及电子鼻咽镜检查以了解鼻咽肿块退缩情况。1.5 统计学方法实验数据采用SPSS10.0软件进行统计学处理,统计学显著水平定为P2检验，血浆EBVDNA拷贝数的比较Mann-WhitneyU非参数和检验。2 结果2.1 每周阳性率及拷贝数分析44例患者放疗期间每周血浆EBVDNN日性率及拷贝数如表1、2。可观察到血浆EBVDNN日性率及拷贝数呈逐渐下降趋势,两两比较发现放疗完成2周时阳性率及拷贝数较前明显下降,差异有统计学意义,其余各周之间

6、阳性率及拷贝数均无明显差异。表1每周血浆EBVDNN日性率（n=44,n/%）项目放疗/t（周）01234567阳性44/10038/86.3610/22.736/13.6402/4.552/4.550P0.2333讨论荧光定量PC做术不仅具有PCR勺高灵敏性，而且不需要扩增后处理,具有快速、准确、不易被污染的特点3,4,为研究患者血浆EBVDNAK平提供了可靠手段。本实验通过每周血浆EBVDNN日性率及拷贝数分析发现，在放疗完成20Gy时,77.27%的患者血浆EBVDNAS速下降至检测水平以下,这与其他学者的研究结果相似5,6。说明在治疗初期多数患者血浆EBVDN冰平迅速下降至检测水平以下

7、。本实验鼻咽癌患者放疗期间血浆EBVDN冰平的动力学曲线主要呈三种形式。59.09%的患者在治疗过程中血浆EBVDN水平逐渐下降至检测水平以下。结合临床肿瘤消退情况发现,放疗40Gy时38.46%患者鼻咽肿块有残留,放疗70Gy时鼻咽癌肿块均完全消退。31.82%的患者在治疗初期出现血浆EBVDN水平高峰,然后迅速下降至检测水平以下,其中2例患者在放疗第6周出现第二高峰。结合临床肿瘤消退情况发现,放疗40Gy时所有鼻咽肿块均有残留,放疗70Gy时,2例出现双讽的患者鼻咽肿块有残留,其余患者肿块完全消退。Lo等5实验结果表明只要检测时间间隔足够短,血浆EBVDN冰平在治疗初期升高的现象在所有鼻咽

8、癌患者中均可观察到。本实验中部分患者未能观察到EBVDN冰平高峰的出现,可能的原因是其高峰落在放疗第1周内,由于检测时间间隔太长故未能检测到。实验观察到这部分患者放疗40Gy时只有38.46%有肿块残留，治疗结束均达到临床缓解。而血浆EBVDN水平高峰出现在1周后的患者,其肿瘤消退速度慢,放疗40Gy时有所有患者鼻咽肿块均有残留,治疗结束时仍有2例患者有肿瘤残留。可能的原因是这部分患者肿瘤放射敏感性较差,肿瘤消退速度更慢导致血浆EBVDN冰平高峰时间推后。实验中还观察到另一种动力学曲线形式,6例患者（包括2例双峰患者）在血浆EBVDN水平降至低于检测水平后,在治疗中后期又出现EBVDN冰平的高山$o对这6例患者进行随访发现，2例患者鼻咽肿块和颈部淋巴结均有残留,2例患者出现远处转移,另2例患者暂未有复发或转移征象。这种在治疗后期出现血浆EBVDN冰平高峰的原因尚不清楚。估计与以下因素有关：与肿瘤细胞的加速再增殖有关。现代放射生物学研究表明在若干人体肿瘤中都存在放疗过程中肿瘤干细胞加速再增殖现象7。可能因残留肿瘤细胞发生加速再增殖现象,导致肿瘤细胞再次大量释放EBVDN微平升高；患者在治疗后期出现微转移,导致血浆EBVDN冰平升高。在随访中也发现这部分患者出现复发或转移的比例较高;肿瘤组