第八章 污染生态学的一般研究方法

1、1污染生态学污染生态学Pollution ecology 第八章第八章 污染生态学的一般研究方法污染生态学的一般研究方法 （Chapter 8: General Methods for Pollution Ecology Research ）主讲：环境科学与工程学院主讲：环境科学与工程学院 王宏镔王宏镔 2012年年12月月14日日2讲授内容讲授内容一、野外调查一、野外调查二、受控实验二、受控实验 （一）体内研究（一）体内研究整体生物试验整体生物试验 （二）体外研究（二）体外研究器官、细胞和亚细胞水平器官、细胞和亚细胞水平试验试验三、多学科交叉三、多学科交叉四、新技术的运用四、新技术的运用 （

2、一）生化和分子水平研究（一）生化和分子水平研究 （二）环境因素（二）环境因素“三致三致”作用的研究技术作用的研究技术 （三）微宇宙试验（三）微宇宙试验3一、野外调查一、野外调查野外调查是真实获得生物与污染环境相互野外调查是真实获得生物与污染环境相互关系第一手资料的关键步骤。关系第一手资料的关键步骤。 能否采集到有代表性的样本是野外调查的能否采集到有代表性的样本是野外调查的关键关键 。在开展野外调查前，需要精心做好准备。在开展野外调查前，需要精心做好准备。采样的记录根据调查目的而定，但要完整，采样的记录根据调查目的而定，但要完整，所记载的参数要全面。所记载的参数要全面。 4一、野外调查一、野外调

3、查野外观测研究技术野外观测研究技术 生态环境样品采集技术生态环境样品采集技术 自然环境观测技术自然环境观测技术 土壤样品采集技术土壤样品采集技术 小气候观测技术小气候观测技术 水样品采集技术水样品采集技术 生物环境观测技术生物环境观测技术 大气样品采集技术大气样品采集技术 野外实验设计技术野外实验设计技术 生物样品采集技术生物样品采集技术5二、受控实验二、受控实验受控实验是在模拟自然生态系统的受控生受控实验是在模拟自然生态系统的受控生态实验系统中研究单项或多项因子相互作态实验系统中研究单项或多项因子相互作用及其对种群或群落影响的方法技术（郑用及其对种群或群落影响的方法技术（郑师章等，师章等，1

4、994）。）。由于野外干扰因素多，生物对污染的反应由于野外干扰因素多，生物对污染的反应是对综合环境条件的反应，要探索单一污是对综合环境条件的反应，要探索单一污染物或污染物之间对生物的联合作用，在染物或污染物之间对生物的联合作用，在实验室内需要进行添加外源污染物的受控实验室内需要进行添加外源污染物的受控实验。实验。 6（一）体内研究（一）体内研究整体生物试验整体生物试验根据暴露时间的长短可分为急性、亚慢性（亚急根据暴露时间的长短可分为急性、亚慢性（亚急性）和慢性毒性试验。性）和慢性毒性试验。急性毒性试验是研究化学物等有害因子大剂量急性毒性试验是研究化学物等有害因子大剂量一一次暴露或次暴露或24h

5、内内多次暴露对所试生物引起的毒性试多次暴露对所试生物引起的毒性试验。验。亚慢性（亚急性）毒性试验是指机体亚慢性（亚急性）毒性试验是指机体连续多日连续多日接接触环境污染物的毒性效应试验，一般暴露时间为触环境污染物的毒性效应试验，一般暴露时间为1-3月月。慢性毒性试验是指机体慢性毒性试验是指机体长期接触长期接触环境污染物的毒环境污染物的毒性效应试验，一般暴露时间为性效应试验，一般暴露时间为6个月至个月至2年年，甚至，甚至终生染毒。终生染毒。二、受控实验二、受控实验7剂量效应关系和剂量反应剂量效应关系和剂量反应关系曲线图关系曲线图剂量10050反应强度（）图 1剂量反应曲线（直线型）剂量10050死

6、亡率（）图2 剂量反应曲线（抛物线型）对数剂量10050死亡率（）图3 剂量反应曲线（S形线型）死亡率（概率单位）对数剂量10050图4 剂量反应曲线8（二）体外研究（二）体外研究器官、细胞器官、细胞和亚细胞水平试验和亚细胞水平试验器官灌流技术；器官灌流技术；单细胞悬液；单细胞悬液；细胞分离技术；细胞分离技术；生物离心技术。生物离心技术。9（三）微宇宙试验（三）微宇宙试验微宇宙法（微宇宙法（microcosm）是研究污染物在生）是研究污染物在生物种群、群落、生态系统和生物圈水平上物种群、群落、生态系统和生物圈水平上生物效应的一种方法，又被称为模型生态生物效应的一种方法，又被称为模型生态系统法（

7、系统法（model ecosystem）。）。微宇宙是自然生态系统的一部分，包括有微宇宙是自然生态系统的一部分，包括有生物和非生物的组织及其过程，能提供自生物和非生物的组织及其过程，能提供自然生态系统的群落结构和功能。然生态系统的群落结构和功能。微宇宙不完全等于自然生态系统，没有自微宇宙不完全等于自然生态系统，没有自然生态系统庞大和复杂，不能包含自然生然生态系统庞大和复杂，不能包含自然生态系统的所有组成。态系统的所有组成。10（三）微宇宙试验（三）微宇宙试验标准化水生微宇宙标准化水生微宇宙（Standardized Aquatic Microcosm，SAM）用于在实验室测定有毒物质在多物种水

8、平对淡用于在实验室测定有毒物质在多物种水平对淡水生态系统的影响。水生态系统的影响。试验时间试验时间64天，容器为天，容器为4L的玻璃广口瓶，试验的玻璃广口瓶，试验生物包括生物包括10种藻、种藻、4种无脊椎动物、种无脊椎动物、1种细菌。种细菌。对温度、光照强度、对温度、光照强度、pH值等理化参数均有具体值等理化参数均有具体要求。要求。11（三）微宇宙试验（三）微宇宙试验烧杯水生微宇宙烧杯水生微宇宙（Mixed Flask Culture，MFC）又称烧杯混合培养，试验时间又称烧杯混合培养，试验时间1214周，容器周，容器为为1L的玻璃广口瓶，试验生物包括的玻璃广口瓶，试验生物包括4种藻、种藻、2

9、种无脊椎动物、一些细菌和原生动物。对温度、种无脊椎动物、一些细菌和原生动物。对温度、光照强度、光照强度、pH值等理化参数均有具体要求。值等理化参数均有具体要求。与与SAM不同的是通过加入来自生态系统浸出液不同的是通过加入来自生态系统浸出液提供给微宇宙中生物群落所需的基质。提供给微宇宙中生物群落所需的基质。12（三）微宇宙试验（三）微宇宙试验室外水生微宇宙室外水生微宇宙（Outdoor Aquatic Microcosm）又称中宇宙（又称中宇宙（Mesocosm），试验单元），试验单元6 m3，试验生物包，试验生物包括浮游植物、浮游动物、鱼类、大型水生植物和无脊括浮游植物、浮游动物、鱼类、大型水

10、生植物和无脊椎动物。椎动物。土壤核心微宇宙土壤核心微宇宙（Soil Core Microcosm，SCM ）该法采用野外环境的土壤核心，将其设置在环境条件控该法采用野外环境的土壤核心，将其设置在环境条件控制的实验室中，试验生物因土壤核心采集场所不同而制的实验室中，试验生物因土壤核心采集场所不同而不同，可研究化学物质和营养元素对农业生态环境的不同，可研究化学物质和营养元素对农业生态环境的影响及其环境归趋。影响及其环境归趋。模拟农田生态系统模拟农田生态系统（Modeling agricultural ecosystem）该系统模拟农田条件，无陆生动物，为同时测定农药在该系统模拟农田条件，无陆生动物

11、，为同时测定农药在土壤、植物、水溶液和空气中的残留而设计，采用土壤、植物、水溶液和空气中的残留而设计，采用0.75 m3的矩形玻璃室，可打入足够数量的空气，通的矩形玻璃室，可打入足够数量的空气，通过玻璃室模拟微风并能收集挥发的农药。过玻璃室模拟微风并能收集挥发的农药。13生态环境样品实验室技术生态环境样品实验室技术植物样品分析技术植物样品分析技术动物样品分析技术动物样品分析技术微生物样品分析技术微生物样品分析技术环境样品分析技术环境样品分析技术14三、多学科交叉三、多学科交叉生态学和环境科学等学科的研究方法均可借鉴到生态学和环境科学等学科的研究方法均可借鉴到污染生态学的研究中污染生态学的研究中

12、 。在实际研究过程中，经常要借助化学、土壤学、在实际研究过程中，经常要借助化学、土壤学、物理化学、植物学、动物学、微生物学、地理学、物理化学、植物学、动物学、微生物学、地理学、水文学、气象学等学科的研究手段。水文学、气象学等学科的研究手段。 为了更进一步研究微观和宏观层次下生物与环境为了更进一步研究微观和宏观层次下生物与环境的相互关系，还需要借助分子生物学、细胞生物的相互关系，还需要借助分子生物学、细胞生物学、遗传学、生物化学、生理学、景观生态学、学、遗传学、生物化学、生理学、景观生态学、全球生态学等的研究方法。全球生态学等的研究方法。 15四、新技术的运用四、新技术的运用（一）（一）生化和分

13、子水平研究生化和分子水平研究一般代谢酶的活性测定一般代谢酶的活性测定 乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶 三磷酸腺苷酶三磷酸腺苷酶解毒系统酶类诱导作用的检测解毒系统酶类诱导作用的检测 混合功能加氧酶混合功能加氧酶 谷胱苷肽硫转移酶谷胱苷肽硫转移酶抗氧化防御系统检测抗氧化防御系统检测 PCR-SSCP（聚合酶链式反应（聚合酶链式反应-单链构象多态性）单链构象多态性）技术技术荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术 DNA损伤试验损伤试验基因芯片技术基因芯片技术16单链构象多态性分析（单链构象多态性分析（SSCP）单链单链DNA在中性条件下会形成二级结构。这种二在中性条件下会形成二级结构。这种二级结构依赖于其碱基的

14、序列。即使只有一个碱基级结构依赖于其碱基的序列。即使只有一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构并可引起非变的不同，也会形成不同的二级结构并可引起非变性条件下的电泳迁移率的差异。性条件下的电泳迁移率的差异。技术路线：技术路线：PCR产物产物95 C变性变性5分钟，立即置冰上。分钟，立即置冰上。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。条件：电泳缓冲液聚丙烯酰胺凝胶电泳。条件：电泳缓冲液0.5 TBE，电压，电压70v, 4 C环境下电泳过夜（环境下电泳过夜（0.2%硝硝酸银染色）。酸银染色）。17荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术（荧光原位杂交技术（fluorescence in situ Hyb

15、ridization, FISH）问世于）问世于70年代后期，年代后期，其原理是标记了荧光的单链其原理是标记了荧光的单链DNA（探针）（探针）和与其互补的和与其互补的DNA（玻片上的标本）退火（玻片上的标本）退火杂交，通过观察荧光信号在染色体上的位置杂交，通过观察荧光信号在染色体上的位置来反映相应基因的情况。来反映相应基因的情况。18荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术 DNA变性：变性： 当溶液中的当溶液中的DNA分子处于高温或高分子处于高温或高pH值值(13)条件下，维持双螺旋在一起的碱基互补对就被破条件下，维持双螺旋在一起的碱基互补对就被破坏，坏，DNA双链解离成两条单链，这一过程叫双链解离

16、成两条单链，这一过程叫DNA变性。变性。 DNA复性：复性： 当温度降低至合适温度或恢复当温度降低至合适温度或恢复pH值至中性，值至中性，两条裂解的单链按碱基互补配对原则重新形成双两条裂解的单链按碱基互补配对原则重新形成双链结构，这一过程叫链结构，这一过程叫DNA复性，又叫复性，又叫DNA杂交。杂交。192021实验方法：实验方法：1.1.探针及标本的变性探针及标本的变性探针变性探针变性：标本变性标本变性：222.2.杂交杂交 DNA探针探针10L滴于已变性并脱水的玻滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上片标本上，盖上1818盖玻片，用盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中封片，置于潮湿暗

17、盒中37杂杂交过夜（约交过夜（约1517h）。）。 233.洗脱洗脱 244.4.杂交信号的放大杂交信号的放大 255.封片封片 可采用不同类型的封片液。如果封片液可采用不同类型的封片液。如果封片液中不含有中不含有Mowiol（可使封片液产生自封（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在封好的玻片标本可以在-20-70的冰箱的冰箱中的暗盒中保持数月之久。中的暗盒中保持数月之久。 262728主要临床特征主要临床特征：严重智力低下，生长迟缓严重智力低下，生长迟

18、缓枕骨扁平，发际低枕骨扁平，发际低眼距宽，外眼角上斜，内眦赘皮眼距宽，外眼角上斜，内眦赘皮鼻根低平，舌大，腭弓高尖鼻根低平，舌大，腭弓高尖通贯手，小指内弯，有一指褶纹通贯手，小指内弯，有一指褶纹男性不育、女性偶有生育能力男性不育、女性偶有生育能力发病率发病率1/600800 新生儿新生儿先天愚形先天愚形(21三体综合征，三体综合征，Down syndrome)2921q22.2 BAC克隆在克隆在Down综合征间期细胞中的杂交信号综合征间期细胞中的杂交信号FISH（荧光原位杂交）（荧光原位杂交）: 荧光标记荧光标记21号染色体探针，与外周血或号染色体探针，与外周血或绒毛、羊水细胞进行原位杂交，

19、患者细胞出绒毛、羊水细胞进行原位杂交，患者细胞出现三个荧光信号。现三个荧光信号。核型报告核型报告： 正常男性核型：正常男性核型： 46，XY 正常女性核型：正常女性核型：46，XXDown综合征：综合征： 47，XX（XY），），+2130（二）环境因素（二）环境因素“三致三致”作用的研究技术作用的研究技术细菌回复突变试验（细菌回复突变试验（bacterial reverse mutation assay）哺乳动物细胞基因突变试验（哺乳动物细胞基因突变试验（mammalian cell gene mutation assay）染色体畸变试验（染色体畸变试验（chromosome aberrat

20、ion test）微核试验（微核试验（micronucleus, MN）显性致死试验（显性致死试验（dominant lethal）小鼠精子畸形试验（小鼠精子畸形试验（sperm shape abnormality test in mice）31细菌回复突变试验（细菌回复突变试验（Ames试验）试验）利用鼠伤寒沙门氏菌突变株，即组氨酸缺陷型，其原始菌株利用鼠伤寒沙门氏菌突变株，即组氨酸缺陷型，其原始菌株菌体内的组氨酸是通过自身一系列酶催化反应合成的，这菌体内的组氨酸是通过自身一系列酶催化反应合成的，这种能自身合成所需营养成份的菌株叫做野生型菌株。种能自身合成所需营养成份的菌株叫做野生型菌株。本试验用鼠伤寒沙门氏菌为突变株，其不能合成组氨酸，而本试验用鼠伤寒沙