微生物浸入试验

1、WORD格式类别：技术标准部门：生产技术部1. 目的 ：冻干生产线压塞、扎盖密封系统完好性验证编码：页码：共 4 页，第 1 页专业资料整理WORD格式1.1. 通过微生物侵入试验确认冻干生产线中压塞、扎盖密封系统是否完好。2. 编制依据 ：2.1 ."药品生产质量管理标准"2021年版2.2 ."中国药典"2021 年版二部3. 支持性文件：标题文件编号存放地点4.概述：4.1. 微生物侵入试验是对容器/密封系统完好性的挑战性试验。在验证试验中，取西林瓶，装入培养基，在正常生产线上压塞、扎盖。此后，将容器密封面侵入高浓度运动菌液中， 取出、培养并检查是

2、否有微生物侵入，以确认容器密封系统完好性。此同时，需作阳性对照试验，确认培养基的促菌生长能力。5.X围：本确认方案适用于本公司冻干生产线压塞、扎盖密封系统完好性验证。6.实验材料大豆胰蛋白胨肉汤培养基 SCDM/2 、铜绿假单胞菌 (ATCC 9027) 、革兰染色、含 0.5的过乙酸的 70异丙醇、冻干粉针生产线西林瓶、胶塞、铝盖、冻干粉针生产线压塞机及轧盖机、盛菌悬液的容器、固*林瓶支架等。7.时间安排年月日年月日专业资料整理WORD格式类别：技术标准部门：生产技术部冻干生产线压塞、扎盖密封系统完好性验证编码：页码：共 4 页，第 2 页专业资料整理WORD格式8.试验步骤8.1.试验用培

3、养基的制备。8.1.1.在生产线上取足够量按相应清洁灭菌规程制备好的西林瓶、灌装已灭菌的 SCDM/2(大豆胰蛋白胨肉汤 )培养基，在冻干生产线上抽真空、压塞及扎盖将西林瓶密封。8.1.2.将密封良好的西林瓶取出，每一西林瓶倒转，使培养基与容器内外表充分接触，并小心去除至少50 个试样的铝盖，注意不要破坏其密封口将去铝盖时不慎损坏容器密封性的所有试样剔除，在 3035下竖放培养 14 天。8.1.3.承受标准：在培养期内，各试样不生长菌。8.2.确认培养基促菌生长能力-营养性试验8.2.1.所有试样培养14天均不长菌时，随机取出20个带盖试样，每个试样内接种 0.1ml 的铜绿假单胞菌 ATC

4、C 9027，菌液浓度： 10100CFU/0.1ML8.2.2.在3035下培养7天，或培养至所有试样都呈阳性结果。8.2.3.假设7天内，所有接种铜绿假单胞菌的试样中，微生物生长良好，那么容器内培养基的促菌生长能力合格。8.2.4.可是使用革兰染色和紫外灯下肉汤呈蓝绿色荧光的性质，来鉴定并确认试样容器内生长的菌为接入的铜绿假单胞菌。8.3.挑战菌悬浮液的制备8.3.1.从铜绿假单胞菌ATCC 9027的新鲜斜面上取一整环培养物，分别接入含 6ml 无菌培养基的试管中，在3035下培养 1618 小时。8.3.2.将每管的培养物分别转入含600ml 一样培养基 SCDM/2 的容器内，于 3

5、035下培养 2224 小时。在培养完毕时，能明显见容器内培养基出现浑浊。8.3.3.在挑战试验开场时，挑战用菌悬液浓度活菌数必须到达：1*10 6CFU/ml。8.3.4 培养完毕后的菌悬液即可用来作压塞、扎盖密封系统系统完好性试验。8.4.微生物侵入试验本试验需在生物平安柜内或其他不影响生产环境的地方进展。专业资料整理WORD格式类别：技术标准部门：生产技术部冻干生产线压塞、扎盖密封系统完好性验证编码：页码：共 4 页，第 3 页专业资料整理WORD格式8.4.1.将新鲜的铜绿假单胞菌ATCC 9027菌悬液倒入适宜的盆中，用金属支架固定试样容器，使试样倒置在菌悬液中。8.4.2.将50个

6、经过冻干线的抽真空、压塞、扎盖的西林瓶的试样倒置入菌悬液中，该组试样记为 A 组。同时，将 25 个去除铝盖的试样容器倒置入菌悬液中，该组试样记为 B 组。试样容器内的无菌培养基应充分接触封口内外表，样品的颈部及封口的外外表应完全浸泡在悬液中 。8.4.3. 实验开场时取一份菌悬液，平板计数每毫升所含的活菌数，并通过革兰染色方法确认微生物是铜绿假单胞菌。8.4.4.将A组及B组试样容器在菌悬液中持续浸泡约4 小时。8.4.5.浸泡完毕时，利用平板计数法计数菌悬液的浓度。从菌悬液中取出试样，擦干试样容器外的剩余菌悬液，然后用含 0.5的过乙酸的 70异丙醇消毒容器外外表。8.4.6.取装满培养基

7、的有铝盖和去铝盖的样品各两个，作为阳性对照。阳性对照试样不经过菌悬液的浸泡，其外表用含0.5的过乙酸的 70异丙醇消毒，后接入 10100CFU 铜绿假单胞菌 ATCC 9027。8.4.7.将消毒后所有的试样放在塑料袋中，在 3035下培养 7 天。在操作过程中不要损坏无铝盖试样胶塞的密封性。8.4.8.培养7天后，对每一试样进展观察检查，有微生物生长记作“+，无微生物生长记作 “。将结果记录在"冻干生产线压塞、扎盖密封系统完好性试验结果记录"。专业资料整理WORD格式类别：技术标准部门：生产技术部冻干生产线压塞、扎盖密封系统完好性验证编码：页码：共 4 页，第 4 页专

8、业资料整理WORD格式8.4.9.如果容器中长菌，利用革兰氏染色法鉴定所长菌为铜绿假单胞菌；如果容器中不长菌，那么从浸过菌悬液的A 组取 10 个试样， B 组取 5 个试样，分别进展微生物营养性试验。注 1：在实验的过程中所有的营养试验必须都合格，这样试样的挑战试验才有效果。注 2：挑战试验所用菌悬液需经过灭菌后丢弃。注 3：在培养期内，发现任何带盖试样长菌时，那么试验无效，须弃去全部试样，重新从头开场 。9.接收标准9.1.微生物营养性试验9.1.1.假设7天内，所有接种铜绿假单胞菌的试样品中，微生物生长良好，那么容器内培养基的促菌生长能力可判为合格。 使用革兰氏染色镜检， 并置于紫外灯下

9、，培养基呈蓝绿色荧光， 那么确定试样品容器内生长的菌为所接入的铜绿假单胞菌，即为阳性。9.1.2.假设7天内，所接种的铜绿假单胞菌的试样品中，微生物生长不良好或鉴别后受其他的污染，那么试验失败，需重新做营养性试验。9.2.微生物侵入试验9.2.1 挑战试验中A组和B组如果长菌，需记录长菌的试样数 ，在A组中如出现长菌试样那么需经过以下要求进一步调查。9.2.2.仔细去除微生物生长的容器的盖和塞，检查容器封口是否有缺损，造成微生物入侵，将检查到试样容器口缺损的应当详细的记录。9.2.3. 如果任何挑战试验中长菌的容器不是由于容器封口明显的物理性缺损所致，那么说明容器 /密封系统挑战试验失败。专业资料整理WORD格式表 1：微生物营养性试验检测记录专业资料整理WORD格式接种日期接种人专业资料整理WORD格式接入菌种培养天数专业资料整理WORD格式检查观察结果检查人复核人专业资料整理WORD格式表 2：冻干生产线压塞、扎盖密封系统完好性试验结果记录加塞扎盖时间营养性试验结论试样浸泡时间试样培养时间浸泡前菌液浓度浸泡后菌液浓度培养完毕后试样容器内微生物的