引物设计丁香园

1、引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发 DNA聚合反应 (即错配)。？具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度(primer length)，产物长度？(product length ),序列Tm值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定 性(internal stability,用G值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构(duplex formation and hairpin )的能值，在错配位点(false primin

2、g site，的引发效率，引物及 产物的GC含量(composition )，等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内 切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如 下要点：？1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于7 4 C,不适于 Ta q DNA 聚合酶进行反应。?2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3?端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3?端出现3个以上的连续碱基，如 GGG或CCC，也会使错误引发机 率增加。?3. 引物3?端的末位碱基对Taq酶的DNA合成

3、效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为 A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应 当避免在引物的3?端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致 PCR反应 失败。5?晞序列对 PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。?4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的G C 含 量 不 能 相 差 太 大。 ?5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72 C左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm = 4(G+C) + 2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest

4、n e i g h b o rmethod)。?6. G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3?端G值较低(绝对值不超过9),而5?晞和中间G值相对较高的引物。 引物的3?嚅的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。？7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过 4.5kcal/mol )易导致产生引物二聚体带，并 且降低引物有效浓度而使 P C R 反应不能正常进行。？8. 对引物的修饰一般是在5?端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载 体 的 相 应 序 列 而 确 定。 ? 值得一提的是，各种模板的引物设计难

5、度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物； 在用作克隆目的的PCR因为 产物序列相对固定，弓I物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。(转载)现在针对PCR引物设计的引物有好几种:Oligo 6.22 Primer 5.0等，如果你对引物没有 特殊要求也可以利用generunner进行设计引物，近来我一直都在用其设计引物效果也是 不错的.具体方法可以参照各自使用说明书 一般是通过设计软件，例如oligo6，primer5等，你可以在网上搜一下引物设计软件下载 和使用说明，是比较容易的。至于设计引物的一般原则如下：*序

6、列选取应在基因的保守区段*避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构*典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在 于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较 长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低* Tm值在55 65 C (因为60 C核酸外切酶活性最高)， GC含量在40% 60%*引物之间的TM相差避免超过2C*引物的3'端避免使用碱基A，引物的3'端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基 *为避免的扩增，引物设计最好能跨两个外显

7、子。* Taqman探针PCR要求片段长度在 80bp 150bp*引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和Co 怎么设计引物来源：？张小伟的日志1. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在 NCBI上搜索不同物种 的同一基因，通过序列分析软件(比如 DNAman)比对(Alignment )，各基因相同的序 列就是该基因的保守区。2. 引物长度一般在1530碱基之间。引物长度(primerlength )常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其 延伸温度大于74 C，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。3. 引物GC含

8、量在40%60%之间，Tm值最好接近72 CGC含量(composition )过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的 Tm值(meltingtemperature )是寡核苷酸的解链温度， 即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值510 C。若按公式Tm=4 (G+C) +2 (A+T)估计引物的Tm值，则有效引物的Tm 为5580 C,其Tm值最好接近72 C以使复性条件最佳。4. 引物3'端要避开密码子的第3位如扩增编码区域，引物3'端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生 简并，

9、会影响扩增的特异性与效率。5. 引物3'端不能选择A,最好选择T引物3'端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3'端最好选择To6. 碱基要随机分布引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3'端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming ）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基 的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3'端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引

10、物在GC富集序列区错误引发。7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin ）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连 续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3'端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续 4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其 G值不要过高（应小于4. 5kcal/mol ）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR反应不能 正常进行。8. 引物5&#

11、39;端和中间厶G值应该相对较高，而3'端厶G值较低。 G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定 性， G值越大，则双链越稳定。应当选用 5'端和中间厶G值相对较高，而3'端厶G值 较低（绝对值不超过9）的引物。引物3'端的 G值过高，容易在错配位点形成双链结 构并引发DNA聚合反应。（不同位置的厶G值可以用Oligo6软件进行分析）9. 引物的5'端可以修饰，而3'端不可修饰引物的5'端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰 而不影响扩增的特异性。引物 5'端修饰包括：加

12、酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、 Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启 动子序列等。引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。3'端也不能有形成任何二级结构 可能。10. 扩增产物的单链不能形成二级结构某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如 RNAstructure ）可以预测估计 mRNA的稳定二级结 构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（ G ）小于58.6lkJ/mol时，扩增往 往不能成功。若不能避开这一区域时，用 7-deaza-2'-

13、脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功 是有帮助的。11. 引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行 BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可 以进行下一步的实验了。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如 GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR,因为产物序列相对固定，弓|物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量 去满足条件。做RealTime时,用于SYBRGreenl法时的一对引物与一般 PCR的引物,在引物设计上 所要求的参数是不同的。引物设计的要求：1）避免重复碱基，尤其是 G.2) Tm=5

14、8-60 度。3）GC=30-80%.4）3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.5）正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。6）PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80 150bp最为合适（可以延长至300bp） o7）引物的退火温度要高，一般要在 60度以上；要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组 DNA污染影响的能力，即引物应该 跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组 DNA污染的 影响。至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都应该可以的做染